Zašto se u pulmologiji radi PCR dijagnostika? Lančana reakcija polimerazom (PCR) - metoda visoke točnosti u otkrivanju specifičnih uzročnika infekcije

PCR dijagnostika - što je to? Bit lančane reakcije polimeraze leži u činjenici da se za proučavanje biološkog materijala koriste markeri posebne vrste koji brzo analiziraju DNK uzročnika infekcije. U ginekologiji postoje različite metode PCR analize kod žena, ovisno o materijalu koji se proučava (krv, urin, brisevi itd.). Nakon obrade podataka otkriva se vrsta patogena (ovo je tzv. "PCR kvalitativna analiza") i/ili njihova koncentracija - ova vrsta istraživanja naziva se " PCR kvantitativni analiza".

Isporuka analiza PCR-om omogućuje vam brzu provjeru uzročnika zarazne patologije kada to nije moguće učiniti drugim analizama (imunološkim, bakteriološkim, mikroskopskim). U suvremenoj laboratorijskoj dijagnostici PCR je najučinkovitiji i Najbolji način otkrivanje DNK mikroba i virusa. Test omogućuje ginekologu i drugim liječnicima klinike ne samo da utvrde uzrok bolesti kod žena i muškaraca, već i da kontroliraju tijek procesa, kako bi ispravno procijenili rezultat terapije.

Cijene PCR dijagnostike

ŠTO PCR POKAZUJE

Kvalitativna PCR analiza ukazuje na izravnu prisutnost uzročnika infekcije u tijelu čovjeka ili životinje. Možete proći i bris gotovo bilo koje lokalizacije (genitalije, uretra, orofarinks, itd.), I PCR testove krvi. Brisem ili struganjem u ginekologiji provjeravaju klamidiju, urea- i mikoplazme, herpes virus, HPV i druge mikrobe. Rezultat DNK analize daje se pacijentu uz zaključak laboratorija "otkriven" ili "nije pronađen". U slučaju krvnog testa, omogućuje vam identificiranje HIV-a, hepatitisa, herpesa, citomegalovirusa i drugih mikroorganizama u ranoj fazi, au nekim slučajevima i određivanje njihovog genotipa i pokazuje broj.

Kvantitativni PCR testovi.
Studija omogućuje ne samo brzo identificiranje željenog genetskog materijala, već i pokazivanje koncentracije njihove DNK (kvantitativna PCR metoda). Utvrđivanje vrste i broja uzročnika važno je pri donošenju odluke o propisivanju liječenja, posebice ako se radi o npr. mikoplazmi (kvantifikacija DNA), tipizaciji ureaplazme (kvantitaciji DNA) ili, što je najvažnije, genotipizaciji i kvantificiranju količine virusa u analizama na HPV infekcija.

REZULTATI PCR-a

Iz svega rečenog jasno je što je PCR analiza i koje su prednosti ove pretrage u ginekologiji. Još važna nijansa ove dijagnostike - dekodiranje rezultata dostupno je i prikladno za neprofesionalce. S obzirom na to koliko se PCR analiza radi u poliklinici, kao i vrijeme zaključka (laboratorij obično daje informaciju za 1-2 dana), ova dijagnostička metoda postaje najbolji izbor za utvrđivanje svih većih ginekoloških i drugih infekcija.

Laboratorij kvalitativnom metodom za provođenje DNK istraživanja na brisevima žena i muškaraca donosi zaključke dvije vrste:

1. "PCR negativno" - u ispitivanom materijalu nije pronađen patogen i
2. "PCR pozitivan" - ​​u testu je pronađena RNA ili DNA mikroba ili virusa.

PCR u ginekologiji

Indikacije za prolazak ovih testova kod žena su sljedeće:

• Sumnja na mogućnost infekcije SPI;
• Anonimna anketa;
• Prisutnost sekreta iz genitalnog trakta, svrbež;
• Bol u donjem dijelu trbuha;
• Nemir prilikom mokrenja;
• Bol tijekom spolnog odnosa;
• Povišeni leukociti u analizi razmaza za floru;
• Prisutnost erozije na cerviksu;
• Planiranje trudnoće;
• Problemi sa začećem i rađanjem djeteta;
• Priprema za ginekološke operacije, IVF;
• U preventivne svrhe.

Gdje je najbolje uzeti PCR testove u Moskvi?
Ova vrsta dijagnostike u ginekologiji odnosi se na suvremene i visokotehnološke metode. PCR testove na infekcije potrebno je raditi u klinici koja ima sve potrebno za dobivanje potpunih rezultata. U našem medicinskom centru materijal uzimaju kvalificirani, iskusni ginekolozi (ne prosječno osoblje u ordinaciji), koriste se jednokratni instrumenti i posebni laboratorijski materijali, a uzorci dobiveni od pacijenata svakodnevno se šalju na posao. To omogućuje ne samo brzo dobivanje rezultata PCR-a, već i osiguranje njihove pouzdanosti. Po želji - potpuna anonimnost ankete.

Koliko košta PCR?
Ovu uslugu pružaju mnoge medicinske ustanove glavnog grada. Na trošak utječu mnogi čimbenici, od lokacije do interne politike cijena. Međutim, postoje objektivni faktori koji određuju prosječnu minimalnu brojku ispod koje se zbog navedenih faktora ne može pružiti kvalitetna i pouzdana usluga. Cijena PCR dijagnostike u moskovskim klinikama za neke infekcije je u prosjeku sljedeća:

• kvalitativna analiza PCR razmaza - 400 - 500 rubalja;
• kvantitativna analiza PCR razmaza - od 600 rubalja (1 jedinica);
• RNA struganje dijagnostika - od 1.000 rubalja (1 jedinica);
• Kvalitativni PCR test krvi (na primjer, za herpes, HPV, Epstein-Barr virus, citomegalovirus) - 450 - 550 rubalja, kvantitativni - od 2000 rubalja;
• HIV DNA kvalitativno (poricanje / potvrda prisutnosti HIV-a u pretkliničkom razdoblju) - od 2.000 rubalja, kvantitativna RNA - od 7.000 rubalja, otpornost - od 14.000 rubalja.

Priprema za PCR

Da bi dobili točne, pouzdane rezultate istraživanja, djevojke i žene trebaju slijediti određena pravila prije odlaska na testiranje na infekcije:

1-2 dana prije posjeta klinici radi testiranja, odbiti spolni odnos;
- suzdržati se od mokrenja 1,5 - 2 sata prije brisa;
- provoditi higijenu vanjskih genitalija s običnom vodom, bez deterdženti, isključite ispiranje;
- isključiti uporabu vaginalnih tableta, čepića;
- nemojte uzimati PCR testove tijekom menstruacije;
- Budući da ste djevica, prije pregleda unaprijed upozorite ginekologa na to.

Kako uzeti PCR testove

Prolazak PCR-a u našoj klinici, uključujući i anonimno, vrlo je jednostavan. Zatim ćemo govoriti o tome kako se PCR uzima od žena i muškaraca i odakle, s kojih je mjesta ova studija najinformativnija.

U slučaju žene, analizu uzima ginekolog. To se obično događa na prvom pregledu kod liječnika ili kada se samo pojavite radi testiranja na infekcije, bez prethodne konzultacije. Sve po vašoj želji. Kažete svoje želje, na koje infekcije biste se željeli testirati, a nakon toga odmah kreće procedura uzimanja materijala. Pacijent se skida ispod struka, nalazi se na stolici. Nakon što je razdvojio male stidne usne, liječnik unosi spekulum odgovarajuće veličine u rodnicu. Ginekolozi uzimaju PCR od žena, obično iz cerviksa, kao i uretre. U potonjem slučaju, prije uvođenja sonde, provodi se kratkotrajna masaža uretre prstom umetnutim u vaginu. U slučaju da PCR analizu rade tinejdžerice ili djevice, tada se ne koristi ogledalo, već se uzorci sekreta uzimaju kroz rupu u himenu ili predvorju rodnice. Dobiveni materijal se stavlja u zapečaćenu epruvetu s posebnim medijem i šalje u laboratorij.

Uzimanje ove analize kod muškaraca nije osobito teško. Sonda se uvodi u uretru na dubini od 3-4 cm, okreće se nekoliko puta u smjeru kazaljke na satu i suprotno od njega. Materijal se također stavlja u epruvetu za daljnju dijagnostiku.

Federalna agencija za obrazovanje

država obrazovna ustanova

Vrhovni strukovno obrazovanje

"Karelijska državna pedagoška akademija"

Nastavni rad na temu:

Lančana reakcija polimerazom (PCR) i njezina primjena

Izvršila: studentica Koryagina Valeria Alexandrovna

Provjerila: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

Uvod

Poglavlje 1 Pregled literature

1.5.4 Efekt platoa

1.5.6 Pojačavanje

Zaključak

Uvod

Posljednjih dvadesetak godina obilježeno je raširenim uvođenjem molekularno-genetičkih metoda u biološke, medicinske i poljoprivredne znanosti.

Do ranih 1970-ih činilo se da je molekularna biologija dosegla određeni stupanj savršenstva. U tom su razdoblju mikroorganizmi bili glavni predmet molekularno-genetičkih istraživanja. Prijelaz na eukariote postavio je istraživače pred potpuno nove probleme koji se nisu mogli riješiti metodama genetske analize koje su postojale u to vrijeme. Proboj u razvoju molekularne genetike postao je moguć zahvaljujući pojavi novog eksperimentalnog alata - restrikcijskih endonukleaza. Sljedećih godina, broj izravnih metoda analize DNA temeljenih na kvalitativno drugačijim pristupima počeo je brzo rasti.

Moderne tehnologije u mnogim slučajevima dopušteno više duboka razina početi proučavati finu strukturnu i funkcionalnu organizaciju nuklearnih i ekstranuklearnih genoma različitih organizama. To je bilo od posebne važnosti za razvoj novih metoda dijagnostike i liječenja raznih bolesti. Ne manje važna bila je i mogućnost korištenja dostignuća molekularne genetike u populacijskoj biologiji i oplemenjivanju za identifikaciju i analizu genetske varijabilnosti populacija, sorti i sojeva, identifikaciju i certificiranje ekonomski vrijednih jedinki, stvaranje genetski modificiranih organizama i rješavanje drugih problema.

Svaka metoda ima svoje prednosti i nedostatke. Ne postoji univerzalna metoda koja bi mogla riješiti sve probleme koji se pojave. Stoga je izbor određene metode za studiju jedna od najvažnijih faza bilo kojeg znanstveni rad.

Poglavlje 1 Pregled literature

1.1 Povijest otkrića lančane reakcije polimerazom (PCR)

Godine 1983. K.B. Mullis i dr. objavili su i patentirali metodu lančane reakcije polimerazom (PCR), kojoj je suđeno da ima dubok utjecaj na sva područja istraživanja i primjene nukleinskih kiselina. Značenje ove metode za molekularnu biologiju i genetiku pokazalo se toliko velikim i očiglednim da je sedam godina kasnije autor dobio Nobelovu nagradu za kemiju.

Na početku korištenja metode, nakon svakog ciklusa zagrijavanja-hlađenja, u reakcijsku smjesu je bilo potrebno dodati DNA polimerazu, budući da je bila inaktivirana na visokoj temperaturi potrebnoj za odvajanje lanaca DNA spirale. Postupak reakcije bio je relativno neučinkovit, zahtijevajući puno vremena i enzima. Godine 1986. metoda lančane reakcije polimerazom značajno je unaprijeđena. Predloženo je korištenje DNA polimeraza iz termofilnih bakterija. Ovi enzimi su se pokazali termostabilnima i mogli su izdržati mnoge reakcijske cikluse. Njihova uporaba omogućila je pojednostavljenje i automatizaciju PCR-a. Jedna od prvih termostabilnih DNA polimeraza izolirana je iz bakterija Thermus aquaticusi imenovani Taq-polimeraza.

Mogućnost umnožavanja bilo kojeg segmenta DNA čiji je slijed nukleotida poznat, te dobivanje istog nakon PCR-a u homogenom obliku i preparativnoj količini, čini PCR alternativnom metodom molekularnog kloniranja kratkih fragmenata DNA. U tom slučaju nema potrebe za primjenom složenih metodoloških tehnika koje se koriste u genetičkom inženjeringu u konvencionalnom kloniranju. Razvoj PCR metode uvelike je proširio metodološke mogućnosti molekularne genetike, a posebice genetskog inženjerstva, toliko da je radikalno promijenio i ojačao znanstveni potencijal mnogih njezinih područja.

1.2 Vrste lančane reakcije polimerazom (PCR)

· Ugniježđeni PCR- koristi se za smanjenje broja nusproizvoda reakcije. Upotrijebite dva para primera i provedite dvije uzastopne reakcije. Drugi par početnica pojačava regiju DNA unutar produkta prve reakcije.

· Invertirani PCR- koristi se kada je poznato samo malo područje unutar željenog niza. Ova metoda je posebno korisna kada je potrebno odrediti susjedne sekvence nakon umetanja DNK u genom. Za provedbu invertirane PCR provodi se serija rezova DNA s restrikcijskim enzimima<#"justify">početnica lančane reakcije polimeraze

· Grupno specifična PCR- PCR za rodbinu<#"center">1.3 Lančana reakcija polimerazom

Otkrivena sredinom 1980-ih, lančana reakcija polimerazom (PCR) može povećati broj kopija originalnog uzorka milijune puta unutar nekoliko sati. Tijekom svakog ciklusa reakcije iz originalne molekule nastaju dvije kopije. Svaka od sintetiziranih kopija DNK može poslužiti kao predložak za sintezu novih kopija DNK u sljedećem ciklusu. Stoga opetovano ponavljanje ciklusa dovodi do eksponencijalnog povećanja broja kopija. Iz izračuna proizlazi da čak i ako postoji 30 ciklusa, broj kopija originalne molekule bit će veći od 1 milijarde. Čak i ako uzmemo u obzir da se svi amplikoni ne dupliciraju tijekom svakog ciklusa, ukupan broj kopija, unatoč tome, prilično je velika brojka.

Svaki ciklus lančane reakcije polimerazom (PCR) sastoji se od sljedećih koraka:

· Denaturacija - Povećanje temperature uzrokuje odmotavanje dvolančane molekule DNA i cijepanje na dvije jednolančane;

· Žarenje - Snižavanje temperature omogućuje pričvršćivanje početnica na komplementarne regije molekule DNA;

· Elongacija – enzim DNA polimeraza dovršava komplementarni lanac.

Za amplifikaciju odabranog fragmenta koriste se dva oligonukleotidna početnica (seeds) koja flankiraju određenu regiju DNA. Primeri usmjereni 3 - završavaju jedan prema drugom i u smjeru niza koji treba pojačati. DNA polimeraza provodi sintezu (dovršavanje) međusobno komplementarnih lanaca DNA, počevši od početnica. Tijekom sinteze DNA, početnice se fizički umeću u lanac novosintetiziranih molekula DNA. Svaki lanac molekule DNA formiran korištenjem jednog od početnica može poslužiti kao predložak za sintezu komplementarnog lanca DNA korištenjem drugog početnica.

1.4 Provođenje lančane reakcije polimerazom (PCR)

Lančana reakcija polimeraze provodi se u posebnim polipropilenskim epruvetama tankih stijenki, kompatibilnih veličine s korištenim termociklerom (pojačivačem) ​​- uređajem koji kontrolira temperaturne i vremenske karakteristike faza lančane reakcije polimeraze (PCR) .

1.5 Princip metode lančane reakcije polimerazom

Lančana reakcija polimerazom (PCR) in vitro je metoda umnožavanja DNK koja može izolirati i umnožiti specifičnu sekvencu DNK milijarde puta unutar nekoliko sati. Mogućnost dobivanja ogromnog broja kopija jedne strogo definirane regije genoma uvelike pojednostavljuje proučavanje postojećeg uzorka DNK.

Za izvođenje lančane reakcije polimerazom potrebno je ispuniti nekoliko uvjeta:

1.5.1 Prisutnost niza komponenata u reakcijskoj smjesi

Glavne komponente reakcijske (PCR) smjese su: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, mješavina nukleotid trifosfata (ATP, GTP, CTP, TTP), početnice (oligonukleotidi), analizirani DNA preparat, termostabilna DNA polimeraza. Svaka od komponenti reakcijske smjese izravno je uključena u lančanu reakciju polimeraze (PCR), a koncentracija reagensa izravno utječe na tijek amplifikacije.

· Tris-HCl - određuje pH reakcijske smjese, stvara puferski kapacitet. Aktivnost DNA polimeraze ovisi o pH medija, pa vrijednost pH izravno utječe na tijek lančane reakcije polimeraze. Obično je pH vrijednost u rasponu od 8 - 9,5. Visok pH je zbog činjenice da kako temperatura raste, pH Tril-HCl pufera pada.

· KCl - koncentracija kalijevog klorida do 50 mm utječe na tijek procesa denaturacije i žarenja, koncentracija iznad 50 mm inhibira DNA polimerazu.

· MgCl 2- jer je DNA polimeraza Mg 2+ - ovisni enzim, tada koncentracija iona magnezija utječe na aktivnost enzima (Mg 2+tvori komplekse s NTP – upravo su ti kompleksi supstrat za polimerazu). Visoka koncentracija dovodi do povećanja nespecifične amplifikacije, a niska dovodi do inhibicije reakcije, optimalna (za različite polimeraze) je u području od 0,5 - 5 mM. Osim toga, koncentracija magnezijevih soli utječe na tijek procesa denaturacije i žarenja – povećanje koncentracije Mg 2+uzrokuje povećanje temperature taljenja DNA (tj. temperature pri kojoj se 50% dvolančanih DNA lanaca razbija u jednolančane).

· NTP - nukleotidni trifosfati su izravni monomeri nukleinskih kiselina. Kako bi se spriječio prekid lanca, preporučuje se jednaki omjer sva četiri nukleotidna trifosfata. Niska koncentracija ovih komponenti u reakcijskoj smjesi povećava vjerojatnost pogrešaka u konstrukciji komplementarnog DNA lanca.

· Primeri - Najoptimalnije je korištenje temeljnih premaza s razlikom tališta ne većom od 2 - 4 o C. Ponekad tijekom dugotrajnog skladištenja na temperaturi od 4 o Sa, ili nakon velikog broja smrzavanja - odmrzavanja, početnice formiraju sekundarne strukture - dimere, smanjujući učinkovitost PCR-a. Otklanjanje ovog problema svodi se na inkubaciju u vodenoj kupelji (T=95 o C) 3 minute i zatim brzo hlađenje na 0° IZ.

· DNA preparati - količina i kvaliteta DNA preparata (matrice) izravno utječe na tijek i parametre lančane reakcije polimeraze. Višak uzorka DNK inhibira lančanu reakciju polimeraze (PCR). nečistoće razne tvari, koji se nalaze u DNA preparatu, također mogu smanjiti učinkovitost lančane reakcije polimeraze (PCR): natrijev acetat, natrijev klorid, izopropanol, etanol, heparin, fenol, urea, hemoglobin itd.

· DNA polimeraza - kada se koristi mala količina DNA polimeraze, uočava se smanjenje sinteze konačnog proizvoda izravno proporcionalno veličini fragmenata. Višak polimeraze za 2-4 puta dovodi do pojave difuznih spektara, a za 4-16 puta, nespecifičnih spektra niske molekularne težine. Raspon korištenih koncentracija je 0,5 - 1,5 jedinica aktivnosti u odnosu na 25 µl PCR smjese.

Uz glavne komponente PCR smjese, koriste se brojne dodatne tvari koje poboljšavaju kvalitativne i kvantitativne pokazatelje PCR: acetamid (5%) - povećanje topljivosti glavnih komponenti; betain (natrijeva sol) - stabilizacija DNA polimeraze, snižavanje tališta DNA, izjednačavanje tališta; goveđi albumin (10-100 μg / ml) - stabilizacija DNA polimeraze; dimetil sulfoksid (1-10%) - povećanje topljivosti glavnih komponenti; formamid (2-10%) - povećanje specifičnosti žarenja; glicerol (15-20%) - povećanje toplinske stabilnosti enzima, smanjenje temperature denaturacije uzorka DNA; amonijev sulfat - snižavanje temperature denaturacije i žarenja.

1.5.2 Ciklus i temperatura

Opći pregled programa lančane reakcije polimerazom (PCR) je sljedeći:

pozornici. Produžena primarna denaturacija DNA preparata.1 ciklus

pozornici. Brza denaturacija DNK preparata. Primer žarenja. Elongacija.30 - 45 ciklusa.

pozornici. Produljeno produljenje. Hlađenje reakcijske smjese 1 ciklus.

Svaki element faze - denaturacija, žarenje, elongacija - ima individualne karakteristike temperature i vremena. Parametri temperature i vremena protoka svakog elementa odabrani su empirijski, u skladu s kvalitativnim i kvantitativnim pokazateljima proizvoda pojačanja.

Denaturacija. Tijekom dati element Lančana reakcija polimeraze razdvaja dvolančanu molekulu DNA u dvije jednolančane. Temperaturni parametri denaturacije su u rasponu od 90 - 95 o C, ali u slučaju uzorka DNA s visokim sadržajem gvanina i citozina, temperaturu treba povećati na 98 o C. Temperatura denaturacije trebala bi biti dovoljna za potpunu denaturaciju - cijepanje DNA lanaca i izbjegavanje "naglog hlađenja" ili brzog žarenja, međutim, termostabilna DNA polimeraza je manje stabilna na visokim temperaturama. Stoga je odabir optimalnih parametara temperature denaturacije za omjer primer/uzorak (priprema DNA) važan uvjet za amplificiranje. Ako je temperatura denaturacije u prvom koraku iznad 95 o C, preporuča se dodavanje DNA polimeraze u reakcijsku smjesu nakon primarne denaturacije. Trajanje ovog elementa faze tijekom lančane reakcije polimeraze (PCR) trebalo bi biti dovoljno za potpunu denaturaciju DNA, ali u isto vrijeme ne bi značajno utjecalo na aktivnost DNA polimeraze na danoj temperaturi.

Žarenje. Temperatura žarenja (T a ) jedan je od najvažnijih parametara lančane reakcije polimeraze. Temperatura žarenja za svaki specifični temeljni premaz odabire se pojedinačno. Ovisi o duljini i nukleotidnom sastavu početnice. Obično je niža za 2 - 4 o Od vrijednosti tališta (T m ) temeljni premaz. Ako je temperatura žarenja sustava ispod optimalne, tada se povećava broj nespecifičnih amplificiranih fragmenata i, obrnuto, viša temperatura smanjuje broj amplificiranih produkata. U tom slučaju, koncentracija specifičnih amplikona može se naglo smanjiti, sve do inhibicije lančane reakcije polimeraze (PCR). Povećanje vremena žarenja također dovodi do povećanja broja nespecifičnih amplikona.

Elongacija. Tipično, svaki tip termostabilne DNA polimeraze ima individualni temperaturni optimum aktivnosti. Brzina sinteze komplementarnog lanca DNA pomoću enzima također je vrijednost specifična za svaku polimerazu (u prosjeku je 30-60 nukleotida u sekundi, ili 1-2 tisuće baza u minuti), pa se vrijeme elongacije odabire ovisno o o vrsti DNA polimeraze i duljini umnožene regije.

1.5.3 Osnovna načela odabira primera

Prilikom izrade PCR test sustava, jedan od glavnih zadataka je pravilan odabir početnica koje moraju zadovoljiti niz kriterija:

Primeri moraju biti specifični. Posebna pažnja posvećena je 3 - krajevi početnica, jer od njih Taq polimeraza počinje dovršavati komplementarni lanac DNA. Ako je njihova specifičnost nedovoljna, tada će se vjerojatno dogoditi neželjeni procesi u epruveti s reakcijskom smjesom, naime sinteza nespecifične DNA (kratki ili dugi fragmenti). Vidljivo je na elektroforezi u obliku teških ili laganih dodatnih traka. To otežava procjenu rezultata reakcije, budući da je lako zamijeniti određeni produkt pojačanja sa sintetiziranom stranom DNA. Dio početnica i dNTP-a troši se za sintezu nespecifične DNA, što dovodi do značajnog gubitka osjetljivosti.

Primeri ne bi trebali stvarati dimere i petlje, t.j. ne bi se smjele formirati stabilne dvostruke niti žarenjem primera međusobno ili međusobno.

1.5.4 Efekt platoa

Treba napomenuti da proces nakupljanja specifičnih produkata pojačanja eksponencijalno traje samo ograničeno vrijeme, a zatim njegova učinkovitost kritično pada. To je zbog takozvanog "plato" efekta.

termin učinak plato koristi se za opisivanje procesa nakupljanja PCR produkata u posljednjim ciklusima amplifikacije.

Ovisno o uvjetima i broju ciklusa reakcije pojačanja, u trenutku kada je učinak postignut plato korištenje supstrata (dNTP i primeri), stabilnost reaktanata (dNTP i enzim), količina inhibitora, uključujući pirofosfate i duplekse DNA, natjecanje za reaktante nespecifičnim produktima ili dimerima primera, specifična koncentracija proizvoda i nepotpuna denaturacija na visoka koncentracija proizvodi za pojačavanje.

Što je niža početna koncentracija ciljne DNA, to je veći rizik od reakcije plato". Ova se točka može dogoditi prije nego što je broj specifičnih proizvoda pojačanja dovoljan za analizu. To mogu izbjeći samo dobro optimizirani testni sustavi.

1.5.5 Priprema uzorka biološkog materijala

Za ekstrakciju DNK koriste se različite tehnike, ovisno o zadacima. Njihova bit leži u ekstrakciji (ekstrakciji) DNA iz biološkog proizvoda i uklanjanju ili neutralizaciji stranih nečistoća kako bi se dobio pripravak DNA čistoće prikladne za PCR.

Metoda dobivanja čistog preparata DNK, koju je opisao Marmur, smatra se standardnom i već je postala klasična. Uključuje enzimatsku proteolizu nakon koje slijedi deproteinizacija i ponovno taloženje DNA alkoholom. Ova metoda omogućuje dobivanje čistog preparata DNK. Međutim, to je prilično naporno i uključuje rad s tako agresivnim i oštrim tvarima kao što su fenol i kloroform.

Jedna od trenutno popularnih metoda je metoda ekstrakcije DNK koju su predložili Boom i sur. Ova se metoda temelji na upotrebi jakog kaotropnog agensa, gvanidin tiocijanata (GuSCN), za lizu stanica i naknadnu sorpciju DNA na nosaču (staklene kuglice, dijatomejska zemlja, stakleno mlijeko, itd.). Nakon ispiranja, DNA ostaje u uzorku adsorbirana na nosaču, s kojeg se lako može ukloniti pomoću pufera za ispiranje. Metoda je praktična, tehnološki napredna i prikladna za pripremu uzorka za amplificiranje. Međutim, mogući su gubici DNA zbog ireverzibilne sorpcije na nosaču, kao i tijekom brojnih ispiranja. Ovo je osobito važno kada se radi s malim količinama DNK u uzorku. Štoviše, čak i tragovi GuSCN-a mogu inhibirati PCR. Stoga je pri korištenju ove metode vrlo važan točan izbor sorbenta i pažljivo poštivanje tehnoloških nijansi.

Druga skupina metoda pripreme uzoraka temelji se na korištenju ionskih izmjenjivača tipa Chilex koji, za razliku od stakla, ne adsorbira DNA, već obrnuto, nečistoće koje ometaju reakciju. Ova tehnologija u pravilu uključuje dvije faze: kuhanje uzorka i adsorpciju nečistoća na ionskom izmjenjivaču. Metoda je izuzetno atraktivna zbog svoje jednostavnosti izvedbe. U većini slučajeva pogodan je za rad s kliničkim materijalom. Nažalost, ponekad postoje uzorci s nečistoćama koje se ne mogu ukloniti pomoću ionskih izmjenjivača. Osim toga, neki se mikroorganizmi ne mogu uništiti jednostavnim kuhanjem. U tim slučajevima potrebno je uvesti dodatne faze obrade uzorka.

Stoga bi izbor metode pripreme uzorka trebao biti tretiran s razumijevanjem svrhe namjeravane analize.

1.5.6 Pojačavanje

Za provođenje reakcije amplifikacije potrebno je pripremiti reakcijsku smjesu i dodati joj analizirani uzorak DNK. U ovom slučaju, važno je uzeti u obzir neke značajke žarenja temeljnog premaza. Činjenica je da, u pravilu, u analiziranom biološkom uzorku postoje različite molekule DNA, s kojima početnice korištene u reakciji imaju djelomičnu, au nekim slučajevima i značajnu, homologiju. Osim toga, primeri se mogu međusobno žariti kako bi formirali primer-dimere. Oba dovode do značajne potrošnje početnica za sintezu sporednih (nespecifičnih) produkata reakcije i, kao rezultat toga, značajno smanjuju osjetljivost sustava. Zbog toga je teško ili nemoguće očitati rezultate reakcije tijekom elektroforeze.

1.6 Sastav standardne PCR reakcijske smjese

x PCR pufer (100 mM otopina Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM otopina KCl, 25 mM otopina MgCl2 ) …….2,5 µl

Voda (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Mješavina nukleotidnih trifosfata (dNTP)

mM otopine svakog…………………………………………….……….0,5 µl

Primer 1 (10 mM otopina) ………………………………………….….1 µl

Primer 2 (10 mM otopina) ………………………………………….….1 µl

DNA polimeraza (5 jedinica / µl) ……………………………………………0,2 µl

DNK uzorak (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Procjena rezultata reakcije

Kako bi se ispravno procijenili rezultati PCR-a, važno je razumjeti da ova metoda nije kvantitativna. Teoretski, produkti amplifikacije pojedinačnih ciljnih molekula DNA mogu se detektirati elektroforezom već nakon 30-35 ciklusa. Međutim, u praksi se to radi samo u slučajevima kada se reakcija odvija u uvjetima bliskim idealnim, što se ne susreće često u životu. Osobito veliki utjecaj na učinkovitost umnožavanja ima stupanj čistoće preparata DNA; prisutnost određenih inhibitora u reakcijskoj smjesi, kojih se u nekim slučajevima može vrlo teško riješiti. Ponekad, zbog njihove prisutnosti, nije moguće amplificirati čak ni desetke tisuća ciljnih molekula DNA. Stoga često ne postoji izravan odnos između početne količine ciljne DNA i konačne količine proizvoda amplifikacije.

Poglavlje 2: Primjena lančane reakcije polimeraze

PCR se koristi u mnogim područjima za analizu iu znanstvenim eksperimentima.

Kriminalistika

PCR se koristi za usporedbu takozvanih "genetičkih otisaka". Trebamo uzorak genetskog materijala s mjesta zločina - krv, slinu, sjeme, kosu itd. Uspoređuje se s genetskim materijalom osumnjičenika. Dovoljna je vrlo mala količina DNK, teoretski – jedna kopija. DNK se reže na fragmente, zatim umnožava PCR-om. Fragmenti se odvajaju DNA elektroforezom. Rezultirajuća slika položaja DNK traka naziva se genetski otisak prsta.

Utvrđivanje očinstva

Rezultati elektroforeze fragmenata DNA umnoženih PCR-om. Otac. Dijete. Majka. Dijete je naslijedilo neke značajke genetskog otiska oba roditelja, što je dalo novi, jedinstveni otisak.

Iako su "genetski otisci" jedinstveni, obiteljske veze još uvijek se može instalirati izradom nekoliko takvih ispisa. Ista se metoda može primijeniti, uz male modifikacije, za uspostavljanje evolucijskih odnosa među organizmima.

Medicinska dijagnostika

PCR omogućuje znatno ubrzanje i olakšavanje dijagnostike nasljednih i virusnih bolesti. Gen od interesa umnožava se PCR-om pomoću odgovarajućih početnica, a zatim se sekvencira kako bi se odredile mutacije. Virusne infekcije mogu se otkriti odmah nakon infekcije, tjednima ili mjesecima prije pojave simptoma bolesti.

Personalizirana medicina

Ponekad su lijekovi toksični ili alergeni za neke pacijente. Razlozi tome dijelom leže u individualnim razlikama u osjetljivosti i metabolizmu lijekova i njihovih derivata. Te su razlike određene na genetskoj razini. Na primjer, kod jednog pacijenta određeni citokrom može biti aktivniji, kod drugog - manje. Kako bi se utvrdilo kakvu vrstu citokroma ima određeni pacijent, predlaže se provesti PCR analizu prije uporabe lijeka. Ova analiza se naziva preliminarna genotipizacija.

Kloniranje gena

Kloniranje gena je proces izolacije gena i, kao rezultat manipulacija genetskog inženjeringa, dobivanje velike količine produkta određenog gena. PCR se koristi za umnožavanje gena, koji se zatim umeće u vektor, dio DNK koji prenosi strani gen u isti organizam ili drugi organizam koji se lako uzgaja. Kao vektori koriste se, na primjer, plazmidi ili virusna DNA. Umetanje gena u strani organizam obično se koristi za dobivanje produkta tog gena - RNK ili, najčešće, proteina. Na taj se način mnogi proteini dobivaju u industrijskim količinama za upotrebu u poljoprivreda, lijek, itd.

Sekvenciranje DNA

U metodi sekvenciranja pomoću fluorescentno ili radioaktivno obilježenih dideoksinukleotida, PCR je sastavni dio, budući da se tijekom polimerizacije derivati ​​nukleotida obilježeni fluorescentnom ili radioaktivnom oznakom ugrađuju u lanac DNA. Ovo zaustavlja reakciju, omogućujući određivanje položaja specifičnih nukleotida nakon odvajanja sintetiziranih niti u gelu.

Mutageneza

Trenutno je PCR postala glavna metoda mutageneze. Primjena PCR-a omogućila je pojednostavljenje i ubrzanje postupka mutageneze, kao i njegovu pouzdanost i ponovljivost.

Metoda PCR omogućila je analizu prisutnosti sekvenci humanog papiloma virusa u dijelovima biopsije humanih cervikalnih neoplazmi ugrađenih u parafin 40 godina prije ove studije. Štoviše, uz pomoć PCR-a bilo je moguće umnožiti i klonirati fragmente mitohondrijske DNA iz fosilnih ostataka ljudskog mozga starog 7 tisuća godina!

Na lizatima pojedinačnih ljudskih spermija dokazana je mogućnost istovremene analize dvaju lokusa koji se nalaze na različitim nehomolognim kromosomima. Ovaj pristup pruža jedinstvenu priliku za finu genetsku analizu i proučavanje kromosomske rekombinacije, polimorfizma DNA itd. Metoda analize pojedinačnih spermija odmah je našla praktičnu primjenu u sudskoj medicini, budući da HLA tipizacija haploidnih stanica omogućuje određivanje očinstva ili identifikaciju kriminalac (HLA kompleks je skup gena ljudskog glavnog histokompatibilnog kompleksa; lokusi HLA kompleksa su najpolimorfniji od svih poznatih kod viših kralježnjaka: unutar vrste, na svakom lokusu, postoji neobično velik broj različiti aleli – alternativni oblici istog gena).

Pomoću PCR-a moguće je identificirati ispravnost integracije stranih genetskih struktura u unaprijed određeno područje genoma proučavanih stanica. Ukupna stanična DNA žari se s dva oligonukleotidna početnica, od kojih je jedan komplementaran mjestu DNA domaćina u blizini točke umetanja, a drugi sekvenci integriranog fragmenta u antiparalelnom lancu DNA. Lančana reakcija polimeraze u slučaju nepromijenjene strukture kromosomske DNA na predloženom mjestu insercije dovodi do stvaranja jednolančanih fragmenata DNA neodređene veličine, a u slučaju planirane insercije, dvolančanih fragmenata DNA poznatih veličina, određena udaljenošću između mjesta žarenja dvaju primera. Štoviše, stupanj pojačanja analizirane regije genoma u prvom slučaju bit će linearno ovisan o broju ciklusa, au drugom - eksponencijalno. Eksponencijalno nakupljanje amplificiranog fragmenta unaprijed određene veličine tijekom PCR-a omogućuje vizualno promatranje istog nakon elektroforetske frakcioniranja preparata DNA i donošenje nedvosmislenog zaključka o umetanju strane sekvence u određeno područje kromosomske DNA.

Zaključak

PCR metoda trenutno je najraširenija metoda za dijagnosticiranje raznih zaraznih bolesti. PCR vam omogućuje prepoznavanje etiologije infekcije, čak i ako uzorak uzet za analizu sadrži samo nekoliko molekula DNA patogena. PCR se široko koristi u rana dijagnoza HIV infekcije virusni hepatitis itd. Do danas gotovo da nema infektivnog agensa koji se ne može otkriti pomoću PCR-a.

Popis korištene literature

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Metode molekularno-genetske analize. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 str.

2.PCR "u realnom vremenu" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. i tako dalje.; izd. b. n. D.V. Rebrikov; predgovor LA. Osterman i akad. RAS i RAAS E.D. Sverdlov; 2. izdanje, rev. i dodatni - M.: BINOM. Laboratorij znanja, 2009. - 223 str.

.Patrushev L.I. Umjetni genetski sustavi. - M.: Nauka, 2005. - U 2 tone

.B. Glick, J. Pasternak Molekularna biotehnologija. Načela i primjena 589 str., 2002

5.Ščelkunov S.N. genetski inženjering. - Novosibirsk: Sib. sveuč. izdavačka kuća, 2004. - 496 str.

Uredio A.A. Vorbjeva "Lančana reakcija polimerazom i njezina primjena u dijagnostici u dermatovenerologiji"; Medicinska novinska agencija - 72 stranice

http://ru. wikipedia.org

http://znanstvenik. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - medicinski časopis

Podučavanje

Trebate li pomoć u učenju teme?

Naši stručnjaci će vam savjetovati ili pružiti usluge podučavanja o temama koje vas zanimaju.
Pošaljite prijavu naznačite temu upravo sada kako biste saznali o mogućnosti dobivanja konzultacija.

PCR dijagnostika(lančana reakcija polimeraze) koristi se za otkrivanje aktivnog stadija bolesti u kombinaciji s već tradicionalnim studijama, kada nema reakcije imunološkim i mikrobiološkim dijagnostičkim metodama.

Jedno vrijeme PCR dijagnostika se koristila samo u znanstvene svrhe, a tek od kraja 20. stoljeća i početka 21. stoljeća ova analiza postaje svojevrsni “zlatni standard” koji je od velike koristi u raznim područjima. medicine.

Što je bit PCR dijagnostike?

PCR dijagnostika, za razliku od one kojom se otkrivaju tragovi antitijela (AT), utvrđuje ne samo temeljne uzroke patološkog stanja, već i pomoću enzima u laboratoriju otkriva prisutnost DNK ili RNK na određenom specifičnom mjestu.

PCR analiza je vrlo precizna, eliminira mogućnost lažnih reakcija i nije potrebno vaditi krv iz vene za pretragu, dovoljna je mala količina uzoraka tkiva, biološka tekućina.

Gornjoj varijanti biološkog okruženja materijala za testiranje koji sadrži navodni infektivni agens, odlukom liječnika može se dodijeliti nekoliko opcija odjednom, uključujući ovo može biti:

• mazati(iscjedak iz genitalija);
• struganje sa sluznice(usta, nos, genitalije);
• slina, ispljuvak ili pleuralna tekućina;
• sok od prostate, proučavanje sekrecije prostate za prisutnost štetnika;
• tkivo placente ili amnionska tekućina;
• opća analiza urina proučavati sediment (nakon centrifugiranja), ako je potrebno, za otkrivanje Mycobacterium tuberculosis;
• cerebrospinalna tekućina za otkrivanje zaraznih lezija središnjeg živčanog sustava;
• prikupljanje stanica ili tkiva(biopsija) iz jetre, dvanaestopalačnog crijeva, želuca itd.

Ti se uzorci stavljaju u poseban reaktor i analiziraju ponovnim udvostručenjem (amplifikacijom) proučavanih fragmenata DNA, ponovljenim ciklusima replikacije i denaturacije uz dodatak specifičnih enzima za sintezu. Ovisno o vrsti lančane reakcije, ovom se metodom utvrđuje vrsta i pojedinačna svojstva DNA ili RNA. U konačnici, PCR proces komparativna analiza klonirani genetski materijal omogućuje vam identificiranje čak i pojedinačnih stanica živog virusa, lako razlikovanje ureaplazme od mikoplazme ili.

Prednosti i nedostaci PCR dijagnostike

Ova PCR dijagnostika ima i prednosti i nekoliko nedostataka.

Prednosti dijagnostike:

• definicija patogena daje izravnu indikaciju prisutnosti u genetskom materijalu atipičnog dijela DNA ili RNA;
• PCR dijagnostika daje 100% točnost zbog prisutnosti u ispitivanom materijalu čestica nukleinskih kiselina (fragmenata DNA ili RNA) karakterističnih samo za određeni virus ili bakteriju;
• visoka osjetljivost PCR sustava u usporedbi s drugim dijagnostičkim metodama. PCR analiza za određivanje prisutnosti patogena dovoljna je za jednu stanicu živog virusa (10-100 stanica u uzorku), što omogućuje otkrivanje patogenog mikroorganizma u ranoj fazi bolesti bez izraženih simptoma. , i u naprednim oblicima;
• visokotehnološka automatizirana PCR amplifikacija povećava brzinu analize testiranjem na dan uzorkovanja (dodjeljujući ne više od 4-6 sati za dijagnozu). To povećava produktivnost i daje nadmoć nad kulturološkim metodama istraživanja;
• Svestranost analize omogućuje, korištenjem genetskog materijala DNA ili RNA, uzetog na različite načine, otkrivanje nekoliko patogena iz jednog biološkog uzorka.

Govoreći o nedostacima, onda, s obzirom na osjetljivost PCR sustava, jedan od neugodnih trenutaka je:

• varijabilnost mikroorganizama. Nedostatak je što je mutacija svojstvena mikroorganizmima, što dovodi do promjene proučavanog genotipa patogena. A sustav PCR testa u umnoženoj regiji genoma ne može uhvatiti hibrid patogena koji se već razvija, kao što ga ljudski imunološki sustav ne prepoznaje, pa neće biti reakcije na utvrđivanje prisutnosti zarazne bolesti. Ali za to su u tijeku različiti razvoji za poboljšanje PCR metode;
• mogućnost dobivanja lažno pozitivnog ili lažno negativnog rezultata. Kako se ne bi susreli s lažnim rezultatima u jednoj od faza PCR dijagnostike, mora se provesti pažljivo, bez kršenja procesa, poštujući pravila za uzimanje materijala. Uzorci mogu promijeniti svoju strukturu ili se čak pokvariti, što može dovesti do lažno negativnog ili lažno pozitivnog rezultata. Treba razumjeti da takav rezultat može biti kada je infekcija već ubijena, ali mrtve stanice nisu imale vremena da se obnove i uzete su u obzir tijekom kloniranja. Stoga, na rani datumi nakon tretmana koriste se druge metode (npr.), a nakon potpune eliminacije neaktivnih uzročnika iz organizma provodi se analiza-kontrola PCR-om. I već liječnik koji je pohađao donosi konačnu odluku o prikladnosti terapije, uzimajući u obzir sve argumente "za" i "protiv".

Priprema za PCR dijagnostiku i uvjeti za testiranje

Vrijedno je obratiti pozornost na jednostavnu pripremu za PCR, za to je potrebno strogo slijediti sve preporuke liječnika i pridržavati se barem nekoliko nepobitnih uvjeta za točniji rezultat.

Ovisno o metodi uzorkovanja materijala za ispitivanje, treba imati na umu da:

• za dijagnostiku s venskom krvlju pacijent mora biti testiran na prazan želudac, isključujući čak i korištenje tekućine;
• dati bris potrebno je suzdržati se od seksualnog kontakta najmanje nekoliko dana, dopušteno je provoditi higijenu genitalnih organa navečer, ali ne na dan testa. Vrijedno je odabrati optimalno vrijeme za studiju, uzimajući u obzir: dva dana prije ili poslije menstrualnog ciklusa;
• za bilo koju metodu uzorkovanja treba prestati koristiti antibakterijsko par tjedana prije poroda lijekovi, nakon prethodnog savjetovanja sa svojim liječnikom, jer to može utjecati na pouzdanost rezultata;
• za analizu urina za određivanje prisutnosti patogena, potrebno je ne samo promatrati sterilnost i higijenu, već i kvalitetu prikupljenog materijala za istraživanje, koji nosi točnije informacije. Stoga je prihvatljivo pričekati 2-3 sata od posljednjeg mokrenja do skupljanja urina ili koristiti jutarnji uzorak, što daje veću vjerojatnost da će se pokazati prisutnost upalnog procesa.

Korištenje PCR-a i otkrivene bolesti

Za traženje uzročnika mnogih bolesti ne treba zanemariti navedene preporuke, a propisani pregled liječnika PCR dijagnostičkom metodom može zaštititi od ozbiljnih komplikacija ne samo odraslu osobu, već i malo, nerođeno dijete u maternici. .

Dapače, upravo ženska polovica populacije najčešće boluje od određenih vrsta virusa (HPV), čime se značajno povećava mogućnost raka grlića maternice ili neplodnosti. I, s obzirom na mogućnost negativan utjecaj na tijek trudnoće i na razvoj fetusa, treba imati na umu da je razne skupine mikroorganizama koji se prenose spolnim putem ili s imunodeficijencijom teško pripisati jednoj ili drugoj skupini uzročnika, jer su međusobno vrlo povezane (npr. , TORCH infekcije i SPI). Ali lančana reakcija polimeraze može pronaći stranu strukturu određivanjem specifične vrste virusne DNK u ženskom tijelu.

Dešifriranje rezultata analize omogućuje vam da potvrdite ili opovrgnete prisutnost bolesti. Obuhvatajući širok raspon uzročnika, takva je analiza vrlo relevantna za pravovremeno otkrivanje mnogih infekcija, kao što su:

• otkrivanje HIV infekcije. Ozbiljno oštećenje imuniteta infekcijom koja primarno zahvaća imunokompetentne stanice prisutne na površini imunološkog sustava na CD4 receptorima, nakon čega gube sposobnost obrane od infekcija i prestaju reagirati na prisutnost RNK virusa u krvnoj plazmi. U slučaju pozitivnog rezultata tijekom anonimnog pregleda, on se ponavlja uz dodatak dodatnih studija;
• virusni hepatitis, najčešće hepatitis C(koji sadrži RNA patogena), koji je zbog lake podnošljivosti teško dijagnosticirati drugim metodama, jer je PCR metoda optimalnija za prepoznavanje uzročnika u krvi ili biopsiji jetre. manifestira se u kasnoj fazi, tvoreći maligni upalni proces. Međutim, vrijedi uzeti u obzir da ako je rezultat pozitivan tijekom testa na prisutnost antitijela u krvi (AT), a PCR test daje negativan rezultat, to može ukazivati ​​na prisutnost virusa u tijelu u vrlo mala količina ili su zahvaćene stanice u fazi čekanja u genomu jetrenih stanica bez pristupa krvotoku. U takvim slučajevima će se provesti niz ponovljenih studija za konačnu dijagnozu i metode liječenja;
• onkogeni virusi kao što je HPV(humani papiloma virus) koji ima više od 100 različite vrste virus koji se prenosi spolnim putem ili tijekom medicinskih postupaka, novorođenče je zaraženo kroz rodni kanal od majke ako je nositelj infekcije papiloma virusom;
• STI(spolno prenosive infekcije);
• pogodan za otkrivanje svih spolno prenosivih bolesti(, gardnereloza,) i TORCH infekcije;
• pokazuje s visokim stupnjem točnosti imaju infekciju mononukleozom, karakteriziran oštećenjem limfnog i retikuloendotelnog sustava (povećani limfni čvorovi, slezena, jetra), može se otkriti pomoću PCR dijagnostike, uzimajući krvni serum kao ispitni materijal. Filatovljeva bolest, prema vanjskim parametrima, može se manifestirati kao osip, žuč koža, bijeli premaz na jeziku.
• , prodirući u krv bolesnika s AIDS-om i primatelja presađenih organa uz upotrebu lijekova za suzbijanje imunološkog sustava;
• herpetička infekcija, predstavlja jednu ili drugu vrstu herpesa koji može utjecati na genitalije, sluznicu očiju ili kožu;
• tuberkuloza. U prisutnosti glavnih simptoma bolesti, PCR analiza je propisana nakon rezultata bronhoskopije, što vam omogućuje dijagnosticiranje aktivnog stadija tuberkuloze mnogo brže nego korištenjem bakteriološke ili bakterioskopske metode;
• virusne zarazne bolesti kao npr krpeljni encefalitis(Borelioza). Karakteriziran oštećenjem stanica živčani sustav, intoksikacija, upala mozga i naknadni razvoj paralize. Za otkrivanje antigena pomoću PCR dijagnostike uzimaju se krv i cerebrospinalna tekućina za izolaciju RNA virusa.
• otkrivanje infekcije Helicobacter pylori(koje dovode do kroničnog gastritisa, peptičkog ulkusa, tumora želuca) PCR dijagnostikom omogućuje otkrivanje DNA Helicobacter pylori (genetski materijal) u biopsiji, fecesu, slini, razlikovanje sojeva prema stupnju malignosti.

PCR dijagnostika infekcija razvija se ubrzanim tempom i uspješno se koristi u onkologiji, ginekologiji, urologiji, gastroenterologiji, virologiji, a popis se stalno ažurira, ali nije ograničen samo na potragu za uzročnicima zaraznih bolesti. Od ostalih praktičnih primjena PCR metode može se izdvojiti i korištenje istraživanja za utvrđivanje očinstva i identifikaciju osobe.

PCR dijagnostika je tehnika koja se temelji na korištenju lančane reakcije polimeraze, kojom se može ispitati osoba na zarazne i nasljedne bolesti. PCR analize za 12 infekcija pokazuju rezultat, bez obzira je li bolest akutna ili kronična. Neki stručnjaci smatraju PCR 12 obveznom analizom i bez nje ne postavljaju konačnu dijagnozu. Rezultati mogu biti pozitivni i puno prije pojave simptoma bolesti.

U 20. stoljeću Cary Mullis iz SAD-a otkrio je fenomen lančane reakcije polimeraze. Trenutno je PCR metoda zlatni standard u nekim područjima medicine. Metoda je najučinkovitija za otkrivanje bolesti u aktivnom stadiju, budući da postoje slučajevi kada konvencionalne metode ne daju tako točan rezultat u aktivnom stadiju.

Dijagnostika zaraznih procesa pomoću PCR-a vrlo je relevantna u moderni svijet. Prednosti ove vrste pregleda su sljedeće:

1. Otkrivanje infektivnog agensa u analizama. Analiza uključuje identifikaciju DNK ili RNK uzročnika infekcije.
2. Lažne i pogrešne reakcije praktički su isključene.
3. PCR metoda 12 je najosjetljivija. Zahvaljujući ovoj metodi mogu se otkriti čak i pojedinačne stanice uzročnika infekcije.
4. Rezultat PCR-a za skrivene patogene je spreman unutar 4 sata nakon postupka.
5. Sposobnost otkrivanja uzročnika infekcije bez odsustva simptoma karakterističnih za bolest. Metoda je vrlo učinkovita u slučaju određene bolesti.

U suvremenom svijetu PCR dijagnostika infekcija razvija se ubrzanim tempom. Tehnika se aktivno poboljšava. Pojavljuju se nove sorte PCR pregledi. Zahvaljujući razvoju ovu metodu pregleda, postaje što dostupniji širem krugu ljudi, a cijena se postupno mijenja.

Osnova lančane reakcije polimeraze

PCR metoda se provodi isključivo u laboratoriju. Za njegovu provedbu koriste se posebni enzimi koji nekoliko puta povećavaju strukturu DNA i RNA pacijenta. Treba formirati toliku količinu DNA i RNA da se može napraviti vizualna analiza. Tijekom pregleda kopira se presjek RNA ili DNA koji idealno odgovara traženim uvjetima.

Laboratorij održava bazu podataka koja navodi točnu strukturu različitih uzročnika infekcije. Zahvaljujući PCR metodi, ne samo da možete vidjeti patogen, već i izračunati njegov kvantitativni omjer.

PCR dijagnostika također uključuje određene inovacije, među kojima se mogu razlikovati sljedeće:

• uvođenje mutacija;
• povezivanje pojedinih fragmenata DNA;
• utvrđivanje očinstva i sl.

Infekcije otkrivene PCR analizom

PCR dijagnostika može otkriti sljedeće infektivne procese:

• hepatitis sljedećih sorti: A, B, C, G;
• Epstein-Barr virus, uzročnik infektivne mononukleoze;
• citomegalovirus;
• Mycobacterium tuberculosis;
• herpes 1 i 2 vrste;
• mnoge spolno prenosive infekcije: ureaplazmoza, gardnereloza, klamidija, mikoplazmoza, trihomonijaza.
• HPV i njegove onkogene podvrste;
• krpeljni encefalitis i borelioza;
• infekcija kandidom;
• listerioza;
• Infekcija Helicobacter pylori.

A ovo su samo neke od najčešćih infekcija koje se mogu otkriti pomoću PCR-a. PCR test krvi se aktivno koristi u ginekološkom polju medicinske prakse, kao iu područjima kao što su:

• pulmološki;
• ftizijatrijski;
• gastroenterološki;
• onkološki;
• mnoge druge grane medicine.

Pravila za prikupljanje materijala za analizu

Strana DNA i RNA mogu se otkriti ispitivanjem različitih tjelesnih tekućina određene osobe. Da bi se ispitala osoba na prisutnost određenih spolno prenosivih infekcija, potrebno je uzeti uzorak iscjetka iz spolnih organa (bris ili struganje) pacijenta i njegov urin.

Ako je potrebno ispitati osobu za različite vrste infekcija (HIV, herpes, hepatitis i druge), tada se uzima PCR analiza za koju se koristi krv pacijenta.

Za dijagnosticiranje herpetičke lezije, mononukleoze, potrebno je uzeti razmaz iz usne šupljine pacijenta. Da bi se potvrdio CMVI, pacijentov urin se uzima na analizu. Postoje slučajevi kada se ispituje cerebrospinalna tekućina kako bi se utvrdili uzroci nastalih neuroloških abnormalnosti.

Istodobno, pulmolog ispituje ispljuvak i tekućinu iz pleure određenog pacijenta metodom PCR.

Ako novorođenče ima sumnju na intrauterinu infekciju, liječnici uzimaju analizu amnionske tekućine od trudnice i komad tkiva posteljice.

Isporuka analize: značajke postupka i interpretacija rezultata

Svi pacijenti pregledani PCR metodom dobivaju najpouzdaniji rezultat. U ovom slučaju, pojava pogrešaka je praktički isključena. Rezultati ove analize pripremaju se dovoljno brzo, što olakšava dijagnozu i osigurava pravodobno imenovanje terapijskih mjera.

Pouzdanost rezultata PCR izravno ovisi o ispravnosti isporuke materijala za ispitivanje. Materijal ne smije biti kontaminiran, inače rezultat studije neće biti objektivan. Najvažnije preporuke prije poduzimanja PCR testa uključuju sljedeće zahtjeve:

1. Zabranjeno je imati seksualnu aktivnost dan prije analize.
2. Krvni test za infekcije mora se uzeti ujutro na prazan želudac.
3. Urin se daje ujutro u sterilnu posudu.

Rezultat analize bit će spreman za 1,5-2 dana nakon dotičnog postupka. Postoje situacije kada se rezultat može pripremiti isti dan.

Dešifriranje rezultata

Rezultat ove vrste pregleda može biti pozitivan ili negativan. Negativan rezultat analize krvi ukazuje na to da u predanom materijalu nema zaraznih elemenata. Velik broj urađenih PCR testova pokazuje negativan nalaz.

Pozitivna PCR analiza potvrđuje činjenicu da su u dostavljenom materijalu pronađeni uzročnici infekcije te je potrebno kvalitetno, što učinkovitije liječenje bolesnika.

Rezultat može biti pozitivan, ali nema manifestacija bolesti. To ukazuje ili na početak bolesti, ili na njenu nosivost. Ako se otkrije nositelj bolesti, tada nisu potrebne nikakve terapijske mjere. Samo trebate vidjeti stručnjaka. Primjeri takvih bolesti su:

• infekcija papiloma virusom;
• herpes, itd.

Obično se nalaze u slini, strugotinama iz cervikalnog kanala, uretre. Međutim, treba imati na umu da bolesna osoba može zaraziti apsolutno zdrave ljude, unatoč činjenici da mu ova bolest ni na koji način ne smeta. Bolest može postati kronična. Treba napomenuti da u slučajevima kada je PCR test krvi pokazao pozitivan rezultat, imenovanje terapijskih mjera jednostavno je potrebno.

PCR analiza također ima kvantitativnu karakteristiku. Kvantitativni rezultat procjenjuje samo stručnjak, on je individualan za različite infekcije. Na temelju kvantitativnih karakteristika, liječnik može razumjeti koliko je aktivan ovaj patološki proces, staviti točnu fazu razvoja određene bolesti. Analizom dobivenih rezultata, stručnjak može odabrati potreban lijek i, eventualno, preispitati dozu lijeka.

Točnost PCR dijagnostike

Stručnjaci dobivaju PCR 3 najvažnije karakteristike, među kojima su:

1. Točnost.
2. Specifičnost.
3. Osjetljivost.

Dijagnostika infekcija PCR-om ima veliku vjerojatnost otkrivanja uzročnika infekcije. PCR analiza krvi i drugih tekućina je vrlo specifična. Uz njegovu pomoć možete lako identificirati određeni zarazni proces. PCR dijagnostika je vrlo osjetljiva. Ako ispitni materijal sadrži minimalnu količinu infektivnih agenasa, PCR metoda će uvijek biti pozitivna.

Najrjeđi je lažno pozitivan rezultat. Ako nema infekcije, nalaz je negativan.

PCR za latentni infektivni proces

Ako se kod osobe sumnja na STI, tada se propisuje krvni test za latentne infekcije. Seksualne bolesti mogu se otkriti samo pregledom bolesnika. Bolesti kao što su:

• klamidija;
• ureaplazmoza;
• gonoreja;
• herpes;
• gardnereloza;
• mikoplazma.

Gore navedene spolne infekcije prilično su česte, au isto vrijeme i podmukle. U početnoj fazi razvoja bolesti ne daju jasne simptome, a pacijenti ne traže pomoć. PCR test krvi, strugotine sa sluznice uretre i cervikalnog kanala su potrebni ako se sumnja na ove infekcije.

SPI imaju vrlo negativan utjecaj na reproduktivni sustav. Mogu uzrokovati neplodnost ili malformacije fetusa. U tom smislu, prije planiranja trudnoće, morate uzeti PCR test.

PCR za 12 infekcija je popularan. Dijagnostika PCR 12 provodi se uzimanjem briseva genitalija. Materijal se uzima 2 sata nakon čina mokrenja. 2 dana prije studije, čepići se ne smiju stavljati u vaginu i ne smiju se izvoditi ispiranje. Rezultat analize bit će spreman za 2 dana.

Cijena PCR-a varira ovisno o infekciji koja se proučava. Cijena se kreće od 200 do 500 rubalja za svaku infekciju. Ući i pregledati se u privatnom laboratoriju možete sami, bez liječničke uputnice.

Lančana reakcija polimerazom poznata je već 30 godina. Široko se koristi u mnogim područjima, od arheologije do genetike.

Metoda PCR pomaže u utvrđivanju očinstva, ali najčešće se koristi za otkrivanje raznih zaraznih bolesti u ljudskom tijelu.

Kako se provodi PCR analiza i što je to? Pokušat ćemo detaljno odgovoriti na ova pitanja.

PCR analiza - što je to?

Lančana reakcija polimerazom (PCR) vrlo je točna metoda molekularne genetske dijagnostike koja omogućuje otkrivanje različitih zaraznih i nasljednih bolesti kod ljudi, kako u akutnom tako iu kroničnom stadiju, i puno prije nego što se bolest manifestira.

PCR metoda je apsolutno specifična i pravilno izvedena ne može dati lažno pozitivan rezultat. Odnosno, ako nema infekcije, onda analiza nikada neće pokazati da jest. Stoga se sada vrlo često, kako bi se potvrdila dijagnoza, uzima dodatna PCR analiza za određivanje patogena i njegove prirode.

Lančanu reakciju polimerazom (PCR) razvio je 1983. Cary Mullis (SAD), za što je nagrađen 1993. Nobelova nagrada u području kemije.

Koja je prednost ove metode?

Dijagnoza ovom metodom omogućuje vam pronalaženje patogena izravno u genu sadržanom u proučavanim materijalima. Ovo je najtočnija analiza za spolne infekcije, latentne infekcije, razne spolno prenosive bolesti.

Razlike između PCR dijagnostike i drugih laboratorijskih istraživačkih metoda su kako slijedi:

• metoda je usmjerena na identifikaciju samog patogena;
• dijagnostika PCR-om je svestrana: za otkrivanje nekoliko patogena;
• bolesti dovoljan je samo jedan biološki uzorak bolesnika;
• metoda je vrlo osjetljiva i nije popraćena drugim križnim reakcijama.

Osim toga, prednost PCR dijagnostike je što je svaki biološki materijal pacijenta prikladan za analizu: krv, izlučevine iz spolnih organa, urin, sperma.

Koje se infekcije mogu otkriti PCR brisom?

Tijelo možda ima veliki broj uzročnici infekcija, ovo uključuje "skrivene", koji se dugo ne manifestiraju.

PCR analiza razmaza omogućuje otkrivanje takvih infekcija:

• ureplasmosis genitalnih organa;
• kandidijaza ();
• herpes;
• prisutnost stanica raka;
• procijeniti hormonsko stanje;

Proučavani materijal za PCR obično je ispljuvak, slina, urin, krv. Prije provođenja analize potrebno je pažljivo se pripremiti za to, nakon prethodnog savjetovanja s liječnikom.

Krv za PCR obično se daje na prazan želudac. Dobri rezultati pokazuju analizu kada se materijal za istraživanje uzima iz cervikalnog kanala ili uretre. U ovom slučaju, najbolje je provesti PCR dijagnostiku najkasnije jedan dan nakon spolnog odnosa.

Vrste PCR

PCR se koristi u mnogim područjima za analizu iu znanstvenim eksperimentima. Postoje različite metode analize:

1. reverzna transkripcija PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR (engleski)) - koristi se za pojačavanje, izolaciju ili identifikaciju poznate sekvence iz biblioteke RNA.
2. Invertirani PCR(Inverse PCR (engleski)) - koristi se ako je poznato samo malo područje unutar željene sekvence. Ova metoda je posebno korisna kada je potrebno odrediti susjedne sekvence nakon umetanja DNK u genom.
3. Ugniježđeni PCR koristi se za smanjenje broja nusproizvoda reakcije. Upotrijebite dva para primera i provedite dvije uzastopne reakcije.
4. Asimetrični PCR(Engleski asimetrični PCR) - provodi se kada je potrebno pojačati uglavnom jedan od lanaca izvorne DNK. Koristi se u nekim tehnikama analize sekvenciranja i hibridizacije.
5. Kvantitativni PCR(Kvantitativni PCR, Q-PCR (engleski)) ili PCR u stvarnom vremenu - koristi se za izravno promatranje mjerenja količine određenog PCR produkta u svakom reakcijskom ciklusu.
6. Stupnjevi PCR (Touchdown PCR (engleski)) - korištenjem ovog pristupa smanjuje se utjecaj nespecifičnog vezanja početnica.
7. Grupno specifična PCR(engleski group-specific PCR) - PCR za srodne sekvence unutar jedne ili između različiti tipovi koristeći konzervativne početnice za ove sekvence.

Ako je nukleotidni slijed predloška djelomično poznat ili uopće nije poznat, mogu se koristiti degenerirani primeri, čiji slijed sadrži degenerirane položaje u kojima se mogu nalaziti bilo koje baze. Na primjer, niz primera može biti: …ATH… gdje je H A, T ili C.

Koji biološki materijali se proučavaju?

Razni biološki mediji i ljudske tekućine mogu poslužiti kao materijal za PCR istraživanje, u kojem se može otkriti strana DNA bakterije ili DNA ili RNA virusa:

1. Urin. Može se koristiti za infektivne lezije genitourinarnog trakta kod muškaraca i mokraćnih organa kod žena (kod muškaraca, korištenje urina kao materijala zamjenjuje struganje epitela).
2. Flegma. Koristi se za dijagnostiku tuberkuloze, a rjeđe za dijagnozu respiratornih oblika klamidije i mikoplazmoze. Sputum u količini od 15-20 ml skuplja se u sterilnu (jednokratnu) bočicu.
3. biološke tekućine. Prema indikacijama uzimaju se sok prostate, pleuralni, cerebrospinalni, amnionska tekućina, zglobna tekućina, bronhoalveolarni lavaž, slina.
4. Strugotine epitela sa sluznice. Obično se koristi za dijagnosticiranje spolno prenosivih bolesti (STD), kao što su gonoreja, klamidija, mikoplazmoza, ureaplazmoza, trihomonijaza, gardnereloza, herpetične i druge infekcije koje zahvaćaju sluznicu.
5. Biopsije. Najčešće se za otkrivanje infekcije Helicobacter pylori koriste uzorci biopsije želuca i dvanaesnika.
6. Krv, plazma, serum. Koristi se za PCR analizu virusa hepatitisa B, C, D, G, herpesa, CMV, HIV-a, ljudskih gena.

Kako se pripremiti za analizu?

Pouzdanost rezultata PCR izravno ovisi o ispravnosti isporuke materijala za ispitivanje. Materijal ne smije biti kontaminiran, inače rezultat studije neće biti objektivan. Najvažnije preporuke prije poduzimanja PCR testa uključuju sljedeće zahtjeve:

1. Urin se daje ujutro u sterilnu posudu.
2. Krvni test za infekcije mora se uzeti ujutro na prazan želudac.
3. Ne biste trebali biti spolno aktivni dan prije testa.

Rezultat analize bit će spreman za 1,5-2 dana nakon dotičnog postupka. Postoje situacije kada se rezultat može pripremiti isti dan.

Dešifriranje analize PRP-a

Proces interpretacije predstavljene studije ističe se svojom jednostavnošću. rezultate pcr analiza može se dobiti za 1,5-2 dana nakon isporuke materijala. U nekim slučajevima nalaz je spreman već prvi dan, a ovo može značiti:

• Negativan rezultat pokazuje da materijal koji se dijagnosticira ne sadrži željeni infektivni agens.
• PCR pozitivan ukazuje da je DNA ili RNA patogena prisutna u ljudskom tijelu.

U nekim slučajevima provodi se kvantitativno određivanje mikroorganizama. To se posebno odnosi na bolesti uzrokovane oportunističkim patogenima. Budući da ove bakterije pokazuju svoje negativne učinke samo kada su u suvišku.

Također, kvantitativna PCR analiza je važna za izbor terapijske taktike i u svrhu praćenja liječenja virusnih infekcija kao što su HIV i virusi hepatitisa.

Koliko je PCR točan u dijagnosticiranju infekcija?

PCR metodu karakterizira visoka točnost, specifičnost i osjetljivost. To znači da ova analiza može:

• točno odrediti prisutnost ili odsutnost infekcije;
• točno navesti o kakvoj se infekciji radi (specifičnost);
• otkriti infekciju čak i pri vrlo niskom sadržaju mikrobne DNA u biološkom materijalu,
• koji je ispitan (osjetljivost).

PCR analiza: cijena i uvjeti

Cijena određene analize ovisit će o tome na koju infekciju ćete se testirati. Okvirne cijene i termini:

1. STI: 300-500 rubalja, termini - 1 dan;
2. Epstein-Barr virus, humani papiloma virus, herpes, citomegalovirus: 300-500 rubalja, termini - 1 dan;
3. Hepatitis A, B, C, D, G: kvalitativna analiza 650 rubalja, kvantitativna analiza 2000 rubalja. Uvjeti - do 5 dana;
4. Antitijela na virus hepatitisa C, ukupna (Anti-HCV) - 420 rubalja;
5. Antitijela na virus hepatitisa C, IgM (Anti-HCV IgM) - 420 rubalja;
6. Helicobacter pylori (Helicobacter pylori): 300-400 rubalja, termini - 1 dan;
7. HIV (protutijela i antigeni) - 380 rubalja;
8. HIV RNA, kvalitativno - 3500 rubalja;
9. HIV RNA, kvantitativno - 11.000 rubalja.

Kako biste uštedjeli novac, možete odabrati fiksni paket analiza. Ovu uslugu pruža većina klinika gdje možete napraviti analizu metodom PRC (in vitro, onclinic, itd.).