Miks tehakse PCR-i diagnostikat pulmonoloogias? Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) - kõrge täpsusega meetod konkreetsete nakkusetekitajate tuvastamiseks

PCR diagnostika - mis see on? Polümeraasi ahelreaktsiooni olemus seisneb selles, et bioloogilise materjali uurimiseks kasutatakse spetsiaalset tüüpi markereid, mis analüüsivad kiiresti nakkusetekitajate DNA-d. Günekoloogias kasutatakse naistel erinevaid PCR-analüüsi meetodeid, olenevalt uuritavast materjalist (veri, uriin, määrded jne). Pärast andmete töötlemist tuvastatakse patogeeni tüüp (see on niinimetatud "PCR-i kvalitatiivne analüüs") ja / või nende kontsentratsioon - seda tüüpi uuringut nimetatakse " PCR kvantitatiivne analüüs".

Analüüside edastamine PCR-iga võimaldab teil kiiresti kontrollida nakkuspatoloogia patogeene, kui seda ei ole võimalik teha teiste analüüsidega (immunoloogilised, bakterioloogilised, mikroskoopiad). Kaasaegses laboridiagnostikas on PCR kõige tõhusam ja Parim viis mikroobide ja viiruste DNA tuvastamine. Test võimaldab günekoloogil ja teistel kliiniku arstidel mitte ainult määrata naiste ja meeste vaevuse põhjust, vaid ka kontrollida protsessi kulgu, hinnata õigesti ravi tulemust.

PCR diagnostika hinnad

MIDA PCR NÄITAB

Kvalitatiivne PCR analüüs näitab nakkustekitaja otsest esinemist inimese või looma kehas. Saate läbida nii peaaegu iga lokaliseerimise (suguelundite, kusiti, orofarünksi jne) määrdumise kui ka PCR-vereanalüüsi. Günekoloogias määrides või kraapides kontrollitakse klamüüdiat, uurea- ja mükoplasmasid, herpesviirust, HPV-d ja muid mikroobe. DNA analüüsi tulemus antakse patsiendile koos labori järeldusega "tuvastatud" või "ei leitud". Vereanalüüsi puhul võimaldab see varakult tuvastada HIV-i, hepatiidi, herpese, tsütomegaloviiruse ja muid mikroorganisme ning mõnel juhul määrata nende genotüübi ja näitab arvu.

Kvantitatiivsed PCR analüüsid.
Uuring võimaldab mitte ainult kiiresti tuvastada soovitud geneetilist materjali, vaid ka näidata nende DNA kontsentratsiooni (kvantitatiivne PCR meetod). Patogeenide tüübi ja arvu määramine on oluline ravi määramise üle otsustamisel, eriti kui näiteks mükoplasma määramine (DNA kvantifitseerimine), ureaplasma tüpiseerimine (DNA kvantifitseerimine) või, mis kõige olulisem, genotüpiseerimine ja viiruskoormuse kvantifitseerimine. HPV infektsioon.

PCR TULEMUSED

Kõigest öeldust on selge, mis on PCR-analüüs ja millised on selle testi eelised günekoloogias. Teine oluline nüanss selle diagnostika – tulemuse dekodeerimine on mitteprofessionaalile kättesaadav ja mugav. Arvestades seda, kui palju kliinikus PCR-analüüse tehakse, samuti järelduse ajastust (laboratoorium väljastab tavaliselt teabe 1-2 päeva jooksul), muutub see diagnostiline meetod parimaks valikuks kõigi suuremate günekoloogiliste ja muude infektsioonide määramiseks.

Naiste ja meeste määrde DNA-uuringute kvalitatiivse meetodiga labor teeb kahte tüüpi järeldusi:

1. "PCR negatiivne" - uuritavas materjalis patogeeni ei leitud ja
2. "PCR positiivne" - testis leiti mikroobi või viiruse RNA või DNA.

PCR günekoloogias

Näidustused nende testide läbimiseks naistel on järgmised:

• STI-ga nakatumise võimaluse kahtlus;
• Anonüümne küsitlus;
• Suguelundite sekretsiooni olemasolu, sügelus;
• Valu alakõhus;
• Ebamugavustunne urineerimisel;
• Valu seksuaalvahekorra ajal;
• Kõrgenenud leukotsüüdid taimestiku analüüsis;
• Erosiooni olemasolu emakakaelal;
• Raseduse planeerimine;
• Probleemid eostamise ja lapse kandmisega;
• Ettevalmistus günekoloogilisteks operatsioonideks, IVF;
• Ennetuslikel eesmärkidel.

Kus on Moskvas parim PCR-testide tegemiseks?
Seda tüüpi diagnostika günekoloogias viitab kaasaegsetele ja kõrgtehnoloogilistele meetoditele. Infektsioonide PCR-testid tuleks teha kliinikus, kus on olemas kõik vajalik täielike tulemuste saamiseks. Meie meditsiinikeskuses võtavad materjali kvalifitseeritud, kogemustega günekoloogid (mitte keskmine personal ravikabinetis), kasutatakse ühekordseid instrumente ja spetsiaalseid laborimaterjale ning patsientidelt saadavad proovid saadetakse igapäevaselt tööle. See võimaldab mitte ainult kiiresti saada PCR-i tulemusi, vaid tagada ka nende usaldusväärsuse. Soovi korral - küsitluse täielik anonüümsus.

Kui palju PCR maksab?
Seda teenust pakuvad paljud pealinna meditsiiniasutused. Kulusid mõjutavad paljud tegurid, alates asukohast kuni sisemise hinnapoliitikani. Siiski on objektiivsed tegurid, mis määravad keskmise miinimumarvu, millest allapoole ei ole võimalik kvaliteetset ja usaldusväärset teenust nimetatud tegurite tõttu pakkuda. PCR-diagnostika hind Moskva kliinikutes mõne infektsiooni korral on keskmiselt järgmine:

• PCR-määrimise kvalitatiivne analüüs - 400-500 rubla;
• PCR-määrde kvantitatiivne analüüs - alates 600 rubla (1 ühik);
• RNA kraapimise diagnostika - alates 1000 rubla (1 ühik);
• PCR-vereanalüüs kvalitatiivne (näiteks herpese, HPV, Epstein-Barri viiruse, tsütomegaloviiruse puhul) - 450-550 rubla, kvantitatiivne - alates 2000 rubla;
• HIV DNA kvalitatiivne (HIV esinemise eitamine / kinnitamine prekliinilisel perioodil) - alates 2000 rubla, kvantitatiivne RNA - alates 7000 rubla, resistentsus - alates 14 000 rubla.

Ettevalmistus PCR jaoks

Õigete ja usaldusväärsete uurimistulemuste saamiseks peaksid tüdrukud ja naised enne nakkustesti laskmist järgima teatud reegleid:

1-2 päeva enne testimiseks kliinikusse minekut keelduda seksuaalvahekorrast;
- hoiduda urineerimast 1,5-2 tundi enne määrdumist;
- teostada välissuguelundite hügieeni puhta veega, ilma pesuvahendid, välistada douching;
- välistada vaginaalsete tablettide, suposiitide kasutamine;
- ärge võtke menstruatsiooni ajal PCR-analüüse;
- Olles neitsi, hoiatage sellest günekoloogi enne läbivaatust.

Kuidas teha PCR-teste

PCR läbimine meie kliinikus, sealhulgas anonüümselt, on üsna lihtne. Järgmisena räägime sellest, kuidas PCR-i naistelt ja meestelt võetakse ning kust, millistest kohtadest see uuring kõige informatiivsem on.

Naise puhul võtab analüüsi günekoloog. Tavaliselt juhtub see esmasel kohtumisel arstiga või siis, kui tulete lihtsalt ilma eelneva konsulteerimiseta infektsioonianalüüse tegema. Kõik vastavalt teie soovile. Ütled välja oma soovid, milliste infektsioonide osas soovid end testida ja peale seda algab vahetult materjali võtmise protseduur. Patsient riietub lahti vööst allpool, asub toolil. Olles eraldanud häbememokad, sisestab arst tuppe sobiva suurusega täkke. Günekoloogid võtavad naistelt PCR-i, tavaliselt emakakaelast, aga ka kusiti. Viimasel juhul tehakse enne sondi sisseviimist ureetra lühiajaline massaaž tuppe sisestatud sõrmega. Juhul, kui PCR-analüüsi teevad teismelised tüdrukud või neitsitüdrukud, siis peeglit ei kasutata ning sekreediproovid võetakse neitsinahas või tupe eesruumis oleva augu kaudu. Saadud materjal asetatakse spetsiaalse söötmega suletud katseklaasi ja saadetakse laborisse.

Selle analüüsi tegemine meestel pole eriti keeruline. Sond sisestatakse ureetrasse 3-4 cm sügavusele, pööratakse mitu korda päri- ja vastupäeva. Materjal pannakse ka katseklaasi edasiseks diagnostikaks.

Föderaalne Haridusagentuur

osariik haridusasutus

Ülim kutseharidus

"Karjala Riiklik Pedagoogikaakadeemia"

Kursusetöö teemal:

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) ja selle rakendamine

Lõpetanud: üliõpilane Koryagina Valeria Aleksandrovna

Kontrollis: Karpikova Natalja Mihhailovna

Petrozavodsk 2013

Sissejuhatus

1. peatükk Kirjanduse ülevaade

1.5.4 Platooefekt

1.5.6 Võimendamine

Järeldus

Sissejuhatus

Viimased kakskümmend aastat on olnud tähistatud molekulaargeneetiliste meetodite laialdase kasutuselevõtuga bioloogia-, meditsiini- ja põllumajandusteadustes.

1970. aastate alguseks tundus, et molekulaarbioloogia oli saavutanud teatud täiuslikkuse. Sel perioodil olid molekulaargeneetiliste uuringute peamiseks objektiks mikroorganismid. Üleminek eukarüootidele esitas teadlastele täiesti uued probleemid, mida tol ajal eksisteerinud geenianalüüsi meetoditega lahendada ei suudetud. Läbimurre molekulaargeneetika arengus sai võimalikuks tänu uue katsevahendi – restriktsiooniendonukleaaside – ilmumisele. Järgnevatel aastatel hakkas kiiresti kasvama kvalitatiivselt erinevatel lähenemisviisidel põhinevate otseste DNA analüüsimeetodite arv.

Kaasaegsed tehnoloogiad paljudel juhtudel lubatud rohkem sügav tase hakata uurima erinevate organismide tuuma- ja tuumaväliste genoomide peenstruktuuri ja funktsionaalset korraldust. See oli eriti oluline uute meetodite väljatöötamiseks erinevate haiguste diagnoosimiseks ja raviks. Vähem oluline polnud ka molekulaargeneetika saavutuste kasutamine populatsioonibioloogias ja aretuses populatsioonide, sortide ja tüvede geneetilise varieeruvuse tuvastamiseks ja analüüsimiseks, majanduslikult väärtuslike isendite tuvastamiseks ja sertifitseerimiseks, geneetiliselt muundatud organismide loomiseks ja muude küsimuste lahendamiseks.

Igal meetodil on oma eelised ja puudused. Pole olemas universaalset meetodit, mis suudaks lahendada kõik esilekerkivad probleemid. Seetõttu on konkreetse meetodi valimine uuringu jaoks üks olulisemaid etappe teaduslik töö.

1. peatükk Kirjanduse ülevaade

1.1 Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) avastamise ajalugu

Aastal 1983 K.B. Mullis jt avaldasid ja patenteerisid polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) meetodi, mis pidi avaldama sügavat mõju kõikidele nukleiinhapete uurimis- ja rakendusvaldkondadele. Selle meetodi tähtsus molekulaarbioloogia ja geneetika jaoks osutus nii suureks ja ilmseks, et seitse aastat hiljem pälvis autor Nobeli keemiaauhinna.

Meetodi kasutamise alguses, pärast iga kuumutamis-jahutustsüklit, tuli reaktsioonisegule lisada DNA polümeraas, kuna see inaktiveeriti kõrgel temperatuuril, mis oli vajalik DNA heeliksi ahelate eraldamiseks. Reaktsiooniprotseduur oli suhteliselt ebaefektiivne, nõudes palju aega ja ensüümi. 1986. aastal täiustati oluliselt polümeraasi ahelreaktsiooni meetodit. On tehtud ettepanek kasutada termofiilsete bakterite DNA polümeraase. Need ensüümid osutusid termostabiilseks ja suutsid vastu pidada paljudele reaktsioonitsüklitele. Nende kasutamine võimaldas PCR-i lihtsustada ja automatiseerida. Bakteritest eraldati üks esimesi termostabiilseid DNA polümeraase Thermus aquaticusja nimega Taq- polümeraas.

Võimalus amplifitseerida mis tahes DNA segmenti, mille nukleotiidjärjestus on teada, ja saada see pärast PCR-i homogeensel kujul ja preparatiivses koguses, muudab PCR alternatiivseks meetodiks lühikeste DNA fragmentide molekulaarseks kloonimiseks. Sel juhul ei ole vaja rakendada keerukaid metoodilisi tehnikaid, mida kasutatakse geenitehnoloogias tavapärasel kloonimisel. PCR-meetodi väljatöötamine on oluliselt avardanud molekulaargeneetika ja eelkõige geenitehnoloogia metodoloogilisi võimalusi niivõrd, et see on radikaalselt muutnud ja tugevdanud paljude oma valdkondade teaduslikku potentsiaali.

1.2 Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) variandid

· Pesastatud PCR- kasutatakse reaktsiooni kõrvalsaaduste arvu vähendamiseks. Kasutage kahte paari praimereid ja viige läbi kaks järjestikust reaktsiooni. Teine praimerite paar võimendab DNA piirkonda esimese reaktsiooni produktis.

· Pööratud PCR- kasutatakse siis, kui soovitud järjestuses on teada vaid väike ala. See meetod on eriti kasulik, kui on vaja määrata naaberjärjestused pärast DNA sisestamist genoomi. Pööratud PCR rakendamiseks tehakse restriktsiooniensüümidega rida DNA-lõikusi<#"justify">polümeraasi ahelreaktsiooni praimer

· Grupispetsiifiline PCR- PCR sugulastele<#"center">1.3 Polümeraasi ahelreaktsioon

1980. aastate keskel avastatud polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) võib mõne tunni jooksul suurendada originaalproovi koopiate arvu miljoneid kordi. Iga reaktsioonitsükli jooksul moodustub algsest molekulist kaks koopiat. Kõik sünteesitud DNA koopiad võivad olla malliks uute DNA koopiate sünteesiks järgmises tsüklis. Seega põhjustab tsüklite korduv kordamine koopiate arvu eksponentsiaalset suurenemist. Arvutustest järeldub, et isegi kui tsüklit on 30, on algse molekuli koopiate arv üle 1 miljardi. Isegi kui võtta arvesse, et iga tsükli jooksul ei dubleerita kõiki amplikone, on koopiate koguarv sellest hoolimata üsna suur näitaja.

Iga polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) tsükkel koosneb järgmistest etappidest:

· Denaturatsioon – temperatuuri tõus põhjustab kaheahelalise DNA molekuli lahtikeeramise ja jagunemise kaheks üheahelaliseks;

· Lõõmutamine – temperatuuri alandamine võimaldab praimeritel kinnituda DNA molekuli komplementaarsetele piirkondadele;

· Elongatsioon – ensüüm DNA polümeraas lõpetab komplementaarse ahela.

Valitud fragmendi amplifitseerimiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidpraimerit (seemneid), mis külgnevad teatud DNA piirkonnaga. Praimeritele orienteeritud 3 - lõpevad üksteise poole ja võimendamist vajava jada suunas. DNA polümeraas teostab üksteist täiendavate DNA ahelate sünteesi (lõpetamist), alustades praimeritest. DNA sünteesi käigus sisestatakse praimerid füüsiliselt äsja sünteesitud DNA molekulide ahelasse. DNA molekuli iga ahel, mis on moodustatud ühe praimeriga, võib olla matriitsiks komplementaarse DNA ahela sünteesil, kasutades teist praimerit.

1.4 Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) läbiviimine

Polümeraasi ahelreaktsioon viiakse läbi spetsiaalsetes õhukeseseinalistes polüpropüleenist katseklaasides, mille suurus ühildub kasutatud termotsükleriga (võimendiga) - seadmega, mis kontrollib polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) etappide temperatuuri ja ajaomadusi. .

1.5 Polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi põhimõte

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on in vitro DNA amplifikatsioonimeetod, mis suudab mõne tunni jooksul eraldada ja korrutada spetsiifilist DNA järjestust miljardeid kordi. Võimalus saada genoomi ühest rangelt määratletud piirkonnast tohutul hulgal koopiaid lihtsustab oluliselt olemasoleva DNA proovi uurimist.

Polümeraasi ahelreaktsiooni läbiviimiseks peavad olema täidetud mitmed tingimused:

1.5.1 Reaktsioonisegus mitme komponendi olemasolu

Reaktsioonisegu (PCR) põhikomponendid on: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, nukleotiidtrifosfaatide (ATP, GTP, CTP, TTP), praimerite (oligonukleotiidide), analüüsitud DNA preparaadi, termostabiilse DNA polümeraasi segu. Iga reaktsioonisegu komponent on otseselt seotud polümeraasi ahelreaktsiooniga (PCR) ja reaktiivide kontsentratsioon mõjutab otseselt amplifikatsiooni kulgu.

· Tris-HCl - määrab reaktsioonisegu pH, loob puhvermahu. DNA polümeraasi aktiivsus sõltub söötme pH-st, seega mõjutab pH väärtus otseselt polümeraasi ahelreaktsiooni kulgu. Tavaliselt on pH väärtus vahemikus 8-9,5. Kõrge pH on tingitud asjaolust, et temperatuuri tõustes Tril-HCl puhvri pH langeb.

· KCl - kaaliumkloriidi kontsentratsioon kuni 50 mm mõjutab denaturatsiooni ja anniilimise protsesside kulgu, üle 50 mm kontsentratsioon inhibeerib DNA polümeraasi.

· MgCl 2- kuna DNA polümeraas on Mg 2+ - sõltuv ensüüm, siis magneesiumiioonide kontsentratsioon mõjutab ensüümi aktiivsust (Mg 2+moodustab NTP-ga komplekse – just need kompleksid on polümeraasi substraadiks). Kõrge kontsentratsioon põhjustab mittespetsiifilise amplifikatsiooni suurenemist ja madal põhjustab reaktsiooni pärssimist, optimaalne (erinevate polümeraaside jaoks) on 0,5-5 mM. Lisaks mõjutab magneesiumisoolade kontsentratsioon denatureerimis- ja anniilimisprotsesside kulgu - Mg kontsentratsiooni suurenemine 2+põhjustab DNA sulamistemperatuuri tõusu (st temperatuuri, mille juures 50% kaheahelalistest DNA ahelatest lõhutakse üheahelalisteks ahelateks).

· NTP - nukleotiidtrifosfaadid on nukleiinhapete otsesed monomeerid. Ahela lõpetamise vältimiseks on soovitatav kõigi nelja nukleotiidtrifosfaadi võrdne suhe. Nende komponentide madal kontsentratsioon reaktsioonisegus suurendab komplementaarse DNA ahela konstrueerimisel esinevate vigade tõenäosust.

· Krundid – kõige optimaalsem on kasutada praimereid, mille sulamistemperatuuri erinevus ei ületa 2–4 o C. Mõnikord pikaajalisel säilitamisel temperatuuril 4 °C o Suure hulga külmutamise-sulatamise korral või pärast seda moodustavad praimerid sekundaarsed struktuurid - dimeerid, vähendades PCR-i efektiivsust. Selle probleemi kõrvaldamine taandub inkubeerimisele veevannis (T = 95 o C) 3 minutit ja sellele järgnev kiire jahutamine 0°-ni FROM.

· DNA preparaadid - DNA preparaadi (maatriksi) kogus ja kvaliteet mõjutavad otseselt polümeraasi ahelreaktsiooni kulgu ja parameetreid. Liigne DNA proov pärsib polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR). lisandid erinevaid aineid, mis on DNA preparaadis, võivad samuti vähendada polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) efektiivsust: naatriumatsetaat, naatriumkloriid, isopropanool, etanool, hepariin, fenool, uurea, hemoglobiin jne.

· DNA polümeraas - väikese koguse DNA polümeraasi kasutamisel täheldatakse lõpptoote sünteesi vähenemist, mis on otseses proportsioonis fragmentide suurusega. Polümeraasi liig 2–4 korda põhjustab hajutatud spektrite ja 4–16 korda madala molekulmassiga mittespetsiifiliste spektrite ilmnemise. Kasutatud kontsentratsioonide vahemik on 0,5–1,5 aktiivsusühikut 25 µl PCR segu kohta.

Lisaks PCR-segu põhikomponentidele kasutatakse mitmeid täiendavaid aineid, mis parandavad PCR-i kvalitatiivseid ja kvantitatiivseid näitajaid: atseetamiid (5%) - põhikomponentide lahustuvuse suurenemine; betaiin (naatriumsool) - DNA polümeraasi stabiliseerimine, DNA sulamistemperatuuri alandamine, sulamistemperatuuri võrdsustamine; veise albumiin (10-100 μg / ml) - DNA polümeraasi stabiliseerimine; dimetüülsulfoksiid (1-10%) - põhikomponentide lahustuvuse suurendamine; formamiid (2-10%) - lõõmutamise spetsiifilisuse suurenemine; glütserool (15-20%) - ensüümi termilise stabiilsuse suurenemine, DNA proovi denaturatsiooni temperatuuri langus; ammooniumsulfaat - denatureerimise ja lõõmutamise temperatuuri alandamine.

1.5.2 Tsükkel ja temperatuur

Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) programmi üldvaade on järgmine:

etapp. DNA preparaadi pikaajaline esmane denaturatsioon.1 tsükkel

etapp. DNA preparaadi kiire denatureerimine. Praimeri lõõmutamine. Pikendus.30 - 45 tsüklit.

etapp. Pikaajaline pikenemine. Reaktsioonisegu jahutamine 1 tsükkel.

Igal etapi elemendil - denatureerimine, lõõmutamine, pikenemine - on individuaalsed temperatuuri- ja ajaomadused. Iga elemendi temperatuuri ja vooluaja parameetrid valitakse empiiriliselt, vastavalt võimendusproduktide kvalitatiivsetele ja kvantitatiivsetele näitajatele.

Denatureerimine. ajal antud element Polümeraasi ahelreaktsioon jagab kaheahelalise DNA molekuli kaheks üheahelaliseks. Denaturatsiooni temperatuuriparameetrid on vahemikus 90–95 o C, kuid suure guaniini ja tsütosiini sisaldusega DNA proovi puhul tuleks temperatuuri tõsta 98 ​​kraadini. o C. Denaturatsiooni temperatuur peaks olema piisav täielikuks denatureerimiseks – DNA ahelate lõikamiseks ja "äkkjahtumise" või kiire anniilimise vältimiseks, kuid termostabiilne DNA polümeraas on kõrgetel temperatuuridel vähem stabiilne. Seega on praimeri/proovi suhte (DNA ettevalmistamine) optimaalsete denatureerimistemperatuuri parameetrite valimine amplifikatsiooni oluline tingimus. Kui denatureerimistemperatuur on esimeses etapis üle 95 o C, on soovitatav lisada reaktsioonisegule DNA polümeraas pärast esmast denatureerimist. Selle etapi elemendi kestus polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) ajal peaks olema piisav DNA täielikuks denatureerimiseks, kuid samal ajal ei tohiks see oluliselt mõjutada DNA polümeraasi aktiivsust antud temperatuuril.

Lõõmutamine. Lõõmutustemperatuur (T a ) on polümeraasi ahelreaktsiooni üks olulisemaid parameetreid. Iga konkreetse praimeri anniilimistemperatuur valitakse individuaalselt. See sõltub praimeri pikkusest ja nukleotiidide koostisest. Tavaliselt on see 2–4 madalam o Sulamistemperatuuri väärtusest (T m ) krunt. Kui süsteemi anniilimistemperatuur on alla optimaalse, siis mittespetsiifiliste amplifitseeritud fragmentide arv suureneb ja vastupidi, kõrgem temperatuur vähendab amplifitseeritud produktide arvu. Sel juhul võib spetsiifiliste amplikonide kontsentratsioon järsult väheneda kuni polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) pärssimiseni. Lõõmutamisaja pikendamine toob kaasa ka mittespetsiifiliste amplikonide arvu suurenemise.

Pikendamine. Tavaliselt on igal termostabiilse DNA polümeraasi tüübil individuaalne aktiivsuse temperatuurioptimum. Komplementaarse DNA ahela sünteesi kiirus ensüümi poolt on samuti igale polümeraasile omane väärtus (keskmiselt on see 30–60 nukleotiidi sekundis ehk 1–2 tuhat alust minutis), seega valitakse pikenemisaeg sõltuvalt DNA polümeraasi tüübi ja amplifitseeritud piirkonna pikkuse kohta.

1.5.3 Praimeri valiku põhiprintsiibid

PCR-testisüsteemi loomisel on üks peamisi ülesandeid praimerite õige valimine, mis peavad vastama mitmele kriteeriumile:

Praimerid peavad olema spetsiifilised. Erilist tähelepanu pööratakse 3 - praimerite otsad, kuna just nendest hakkab Taq polümeraas täiendama DNA ahelat. Kui nende spetsiifilisus on ebapiisav, siis on tõenäoline, et reaktsiooniseguga katseklaasis toimuvad soovimatud protsessid, nimelt mittespetsiifilise DNA (lühikesed või pikad fragmendid) süntees. See on elektroforeesil nähtav raskete või kergete lisaribade kujul. See muudab reaktsiooni tulemuste hindamise keeruliseks, kuna spetsiifilist amplifikatsiooniprodukti on lihtne segi ajada sünteesitud võõr-DNA-ga. Osa praimeritest ja dNTP-dest kulub mittespetsiifilise DNA sünteesiks, mis viib olulise tundlikkuse vähenemiseni.

Praimerid ei tohiks moodustada dimeere ja silmuseid, st. praimereid enda või üksteise külge anniilides ei tohiks moodustada stabiilseid topeltkiude.

1.5.4 Platooefekt

Tuleb märkida, et spetsiifiliste võimendusproduktide kogunemise protsess võtab eksponentsiaalselt vaid piiratud aja ja seejärel langeb selle efektiivsus kriitiliselt. See on tingitud nn platoo efektist.

tähtajaline mõju platoo kasutatakse PCR-produktide akumuleerumisprotsessi kirjeldamiseks viimastes amplifikatsioonitsüklites.

Sõltuvalt amplifikatsioonireaktsiooni tingimustest ja tsüklite arvust mõju saavutamise ajal platoo substraadi kasutamine (dNTP-d ja praimerid), reagendi stabiilsus (dNTP-d ja ensüüm), inhibiitorite, sealhulgas pürofosfaatide ja DNA duplekside hulk, konkurents reagentide pärast mittespetsiifiliste toodete või praimer-dimeeride poolt, toote spetsiifiline kontsentratsioon ja mittetäielik denaturatsioon kõrge kontsentratsioon võimendustooted.

Mida madalam on sihtmärk-DNA algkontsentratsioon, seda suurem on reaktsiooni oht platoo". See punkt võib ilmneda enne, kui konkreetsete amplifikatsiooniproduktide arv on analüüsimiseks piisav. Seda saavad vältida ainult hästi optimeeritud testimissüsteemid.

1.5.5 Bioloogilise materjali proovide ettevalmistamine

Sõltuvalt ülesannetest kasutatakse DNA ekstraheerimiseks erinevaid tehnikaid. Nende olemus seisneb DNA ekstraheerimises (ekstraheerimises) bioloogilisest tootest ja võõrlisandite eemaldamises või neutraliseerimises, et saada PCR jaoks sobiva puhtusega DNA preparaat.

Marmuri kirjeldatud puhta DNA preparaadi saamise meetodit peetakse standardseks ja see on juba muutunud klassikaliseks. See hõlmab ensümaatilist proteolüüsi, millele järgneb deproteiniseerimine ja DNA ümbersadestamine alkoholiga. See meetod võimaldab saada puhast DNA preparaati. See on aga üsna töömahukas ja hõlmab töötamist selliste agressiivsete ja teravate ainetega nagu fenool ja kloroform.

Üks praegu populaarseid meetodeid on DNA ekstraheerimise meetod, mille on välja pakkunud Boom et al. See meetod põhineb tugeva kaotroopse aine, guanidiintiotsüanaadi (GuSCN) kasutamisel rakkude lüüsiks ja sellele järgneval DNA sorptsioonil kandjal (klaashelmed, kobediatomiit, klaaspiim jne). Pärast pesemist jääb DNA kandjale adsorbeeritud proovi, kust seda saab elueerimispuhvriga hõlpsasti eemaldada. Meetod on mugav, tehnoloogiliselt arenenud ja sobib proovide ettevalmistamiseks võimendamiseks. Kuid DNA kadu on võimalik kandjal pöördumatu sorptsiooni tõttu, aga ka arvukate pesemiste ajal. See on eriti oluline proovis väikese koguse DNA-ga töötamisel. Lisaks võivad isegi väikesed GuSCN-i kogused pärssida PCR-i. Seetõttu on selle meetodi kasutamisel väga oluline sorbendi õige valik ja tehnoloogiliste nüansside hoolikas järgimine.

Teine proovide ettevalmistamise meetodite rühm põhineb Chilex-tüüpi ioonivahetite kasutamisel, mis erinevalt klaasist ei adsorbeeri DNA-d, vaid vastupidi, reaktsiooni segavaid lisandeid. Reeglina sisaldab see tehnoloogia kahte etappi: proovi keetmine ja lisandite adsorptsioon ioonivahetile. Meetod on selle teostamise lihtsuse tõttu äärmiselt atraktiivne. Enamasti sobib see kliinilise materjaliga töötamiseks. Kahjuks on mõnikord proovides lisanditega, mida ei saa ioonivahetitega eemaldada. Lisaks ei saa mõningaid mikroorganisme lihtsalt keetmisega hävitada. Nendel juhtudel on vaja sisse viia proovi töötlemise täiendavad etapid.

Seega tuleks proovi ettevalmistamise meetodi valikut käsitleda kavandatud analüüside eesmärkide mõistmisega.

1.5.6 Võimendamine

Amplifikatsioonireaktsiooni läbiviimiseks on vaja reaktsioonisegu ette valmistada ja sellele lisada analüüsitud DNA proov. Sel juhul on oluline arvestada praimeri lõõmutamise mõningate omadustega. Fakt on see, et reeglina on analüüsitavas bioloogilises proovis erinevaid DNA molekule, millega reaktsioonis kasutatud praimerid on osalise ja mõnel juhul olulise homoloogiaga. Lisaks võivad praimerid üksteisega liituda, moodustades praimer-dimeerid. Mõlemad põhjustavad kõrvalreaktsioonide (mittespetsiifiliste) produktide sünteesiks olulist praimerite tarbimist ja vähendavad selle tulemusena oluliselt süsteemi tundlikkust. See muudab reaktsiooni tulemuste lugemise elektroforeesi ajal keeruliseks või võimatuks.

1.6 Standardse PCR reaktsioonisegu koostis

x PCR puhver (100 mM Tris-HCl lahus, pH 9,0, 500 mM KCl lahus, 25 mM MgCl2 lahus ) …….2,5 µl

Vesi (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Nukleotiidtrifosfaatide (dNTP) segu

mM lahus iga ………………………………………….……….0,5 µl

Praimer 1 (10 mM lahus) …………………………………………….….1 µl

Praimer 2 (10 mM lahus) …………………………………………….….1 µl

DNA polümeraas (5 ühikut / µl) ……………………………………………… 0,2 µl

DNA proov (20 ng/µl) ……………………………………………..1 µl

1.7 Reaktsioonitulemuste hindamine

PCR-i tulemuste õigeks hindamiseks on oluline mõista, et see meetod ei ole kvantitatiivne. Teoreetiliselt saab üksikute sihtmärk-DNA molekulide amplifikatsiooniprodukte elektroforeesiga tuvastada juba 30–35 tsükli järel. Praktikas tehakse seda aga vaid juhtudel, kui reaktsioon toimub ideaalilähedastes tingimustes, mida elus sageli ei kohta. DNA preparaadi puhtusaste mõjutab eriti palju amplifikatsiooni efektiivsust; teatud inhibiitorite olemasolu reaktsioonisegus, millest mõnel juhul võib olla äärmiselt raske vabaneda. Mõnikord ei ole nende olemasolu tõttu võimalik amplifitseerida isegi kümneid tuhandeid sihtmärk-DNA molekule. Seega puudub sageli otsene seos sihtmärk-DNA esialgse koguse ja amplifikatsiooniproduktide lõpliku koguse vahel.

2. peatükk: Polümeraasi ahelreaktsiooni rakendused

PCR-i kasutatakse paljudes valdkondades analüüsiks ja teaduslikeks katseteks.

Kriminalistika

PCR-i kasutatakse niinimetatud "geneetiliste sõrmejälgede" võrdlemiseks. Vajame kuriteopaiga geneetilise materjali proovi – veri, sülg, sperma, juuksed jne. Seda võrreldakse kahtlusaluse geneetilise materjaliga. Piisab väga väikesest kogusest DNA-st, teoreetiliselt – ühest koopiast. DNA lõigatakse fragmentideks, seejärel amplifitseeritakse PCR abil. Fragmendid eraldatakse DNA elektroforeesiga. Saadud pilti DNA ribade asukohast nimetatakse geneetiliseks sõrmejäljeks.

Isaduse tuvastamine

PCR-ga amplifitseeritud DNA fragmentide elektroforeesi tulemused. Isa. Laps. Ema. Laps päris mõlema vanema geneetilise jälje mõned tunnused, mis andis uue ainulaadse jälje.

Kuigi "geneetilised sõrmejäljed" on ainulaadsed, perekondlikud sidemed seda saab siiski paigaldada, tehes mitu sellist väljatrükki. Sama meetodit saab väikeste muudatustega rakendada organismide vaheliste evolutsiooniliste suhete tuvastamiseks.

Meditsiiniline diagnostika

PCR võimaldab oluliselt kiirendada ja hõlbustada pärilike ja viirushaiguste diagnoosimist. Huvipakkuvat geeni amplifitseeritakse PCR abil, kasutades sobivaid praimereid, ja seejärel sekveneeritakse mutatsioonide määramiseks. Viirusnakkusi saab avastada kohe pärast nakatumist, nädalaid või kuid enne haiguse sümptomite ilmnemist.

Personaliseeritud meditsiin

Mõnikord on ravimid mõne patsiendi jaoks mürgised või allergeensed. Selle põhjuseks on osaliselt individuaalsed erinevused ravimite ja nende derivaatide tundlikkuses ja metabolismis. Need erinevused määratakse geneetilisel tasandil. Näiteks võib ühel patsiendil teatud tsütokroom olla aktiivsem, teises - vähem. Selleks, et teha kindlaks, millist tüüpi tsütokroom konkreetsel patsiendil on, on soovitatav enne ravimi kasutamist teha PCR-analüüs. Seda analüüsi nimetatakse esialgseks genotüpiseerimiseks.

Geenide kloonimine

Geenide kloonimine on protsess, mille käigus eraldatakse geenid ja saadakse geenitehnoloogia manipulatsioonide tulemusena suures koguses antud geeni produkti. PCR-i kasutatakse geeni amplifitseerimiseks, mis seejärel sisestatakse vektorisse, DNA tükki, mis kannab võõrgeeni samasse organismi või mõnda teise organismi, mida on lihtne kasvatada. Vektoritena kasutatakse näiteks plasmiide ​​või viiruse DNA-d. Tavaliselt kasutatakse geenide sisestamist võõrorganismi selle geeni produkti - RNA või kõige sagedamini valgu saamiseks. Sel viisil saadakse palju valke tööstuslikes kogustes kasutamiseks põllumajandus, ravim jne.

DNA sekveneerimine

Fluorestseeruvalt või radioaktiivselt märgistatud dideoksünukleotiide kasutavas sekveneerimismeetodis on PCR lahutamatu osa, kuna just polümerisatsiooni käigus sisestatakse DNA ahelasse fluorestseeruva või radioaktiivse märgisega märgistatud nukleotiidderivaadid. See peatab reaktsiooni, võimaldades pärast sünteesitud ahelate eraldamist geelis määrata konkreetsete nukleotiidide asukohad.

Mutagenees

Praegu on PCR-st saanud peamine mutageneesi meetod. PCR kasutamine võimaldas mutageneesi protseduuri lihtsustada ja kiirendada, samuti muuta see usaldusväärsemaks ja reprodutseeritavamaks.

PCR-meetod võimaldas analüüsida inimese papilloomiviiruse järjestuste esinemist inimese emakakaela kasvajate biopsiate lõikudes, mis olid sisestatud parafiini 40 aastat enne seda uuringut. Pealegi oli PCR abil võimalik amplifitseerida ja kloonida mitokondriaalse DNA fragmente 7 tuhande aasta vanuste inimaju fossiilsetest jäänustest!

Inimese üksikute spermatosoidide lüsaatidel demonstreeriti võimalust analüüsida samaaegselt kahte erineval mittehomoloogsel kromosoomil paiknevat lookust. Selline lähenemine annab ainulaadse võimaluse peeneks geneetiliseks analüüsiks ning kromosoomide rekombinatsiooni, DNA polümorfismi jms uurimiseks. Üksikute spermatosoidide analüüsimeetod leidis kohe praktilise rakenduse kohtumeditsiinis, kuna haploidsete rakkude HLA tüpiseerimine võimaldab määrata isadust või tuvastada. kurjategija (HLA kompleks on inimese peamise histo-sobivuse kompleksi geenide kogum; HLA kompleksi lookused on kõrgematel selgroogsetel teadaolevatest kõige polümorfsemad: liigi sees, igas lookuses on ebatavaliselt palju erinevad alleelid – sama geeni alternatiivsed vormid).

PCR abil on võimalik tuvastada võõraste geneetiliste struktuuride integreerimise õigsust uuritavate rakkude genoomi etteantud piirkonnas. Kogu raku DNA anniilitakse kahe oligonukleotiidpraimeriga, millest üks on komplementaarne peremees-DNA saidiga sisestuspunkti lähedal ja teine ​​antiparalleelse DNA ahela integreeritud fragmendi järjestusega. Polümeraasi ahelreaktsioon kromosomaalse DNA muutumatu struktuuri korral kavandatavas sisestuskohas põhjustab määramata suurusega üheahelaliste DNA fragmentide ja kavandatud sisestamise korral teadaoleva kaheahelaliste DNA fragmentide moodustumist. suurus, mis on määratud kahe praimeri anniilimiskohtade vahelise kaugusega. Veelgi enam, genoomi analüüsitud piirkonna amplifikatsiooni aste sõltub esimesel juhul lineaarselt tsüklite arvust ja teisel juhul eksponentsiaalselt. Ettemääratud suurusega amplifitseeritud fragmendi eksponentsiaalne akumuleerumine PCR-i ajal võimaldab seda visuaalselt jälgida pärast DNA preparaadi elektroforeetilist fraktsioneerimist ja teha ühemõttelise järelduse võõrjärjestuse sisestamise kohta kromosomaalse DNA antud piirkonda.

Järeldus

PCR meetod on praegu enim kasutatav erinevate nakkushaiguste diagnoosimise meetodina. PCR võimaldab tuvastada nakkuse etioloogiat, isegi kui analüüsiks võetud proov sisaldab vaid mõnda patogeeni DNA molekuli. PCR-i kasutatakse laialdaselt varajane diagnoosimine HIV-nakkused viiruslik hepatiit jne. Praeguseks ei ole peaaegu ühtegi nakkustekitajat, mida ei saaks PCR abil tuvastada.

Kasutatud kirjanduse loetelu

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Molekulaar-geneetilise analüüsi meetodid. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 lk.

2.PCR "reaalajas" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. ja jne; toim. b. n. D.V. Rebrikov; eessõna L.A. Osterman ja akad. RAS ja RAAS E.D. Sverdlov; 2. väljaanne, rev. ja täiendav - M.: BINOM. Teadmiste labor, 2009. - 223 lk.

.Patrušev L.I. Kunstlikud geneetilised süsteemid. - M.: Nauka, 2005. - 2 tonnis

.B. Glick, J. Pasternak Molekulaarne biotehnoloogia. Põhimõtted ja rakendus 589 lk, 2002.a

5.Shchelkunov S.N. geenitehnoloogia. - Novosibirsk: Sib. univ. kirjastus, 2004. - 496 lk.

Toimetanud A.A. Vorbjeva "Polümeraasi ahelreaktsioon ja selle rakendamine diagnostikas dermatovenereoloogias"; Meditsiiniuudiste agentuur - 72 lehekülge

http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - meditsiiniline ajakiri

Õpetamine

Vajad abi teema õppimisel?

Meie eksperdid nõustavad või pakuvad juhendamisteenust teile huvipakkuvatel teemadel.
Esitage taotlus märkides teema kohe ära, et saada teada konsultatsiooni saamise võimalusest.

PCR diagnostika(polümeraasi ahelreaktsioon) kasutatakse haiguse aktiivse staadiumi tuvastamiseks koos juba traditsiooniliste uuringutega, kui immunoloogiliste ja mikrobioloogiliste diagnostiliste meetoditega reaktsioon puudub.

Teatud aja jooksul kasutati PCR-diagnostikat ainult teaduslikel eesmärkidel ja alles 20. sajandi lõpust ja 21. sajandi algusest sai sellest analüüsist omamoodi “kuldstandard”, millest on erinevates valdkondades palju kasu. meditsiinist.

Mis on PCR-diagnostika olemus?

PCR-diagnostika, erinevalt antikehade (AT) jälgede tuvastamise võimalusest, tuvastab mitte ainult patoloogilise seisundi algpõhjused, vaid tuvastab ka DNA või RNA olemasolu konkreetses kohas, kasutades laboris ensüüme.

PCR analüüs on ülitäpne, välistades valereaktsioonide võimaluse ning uurimiseks ei ole vaja veenist verd võtta, piisab väikesest kogusest koeproovidest, bioloogilisest vedelikust.

Väidetavat nakkusetekitajat sisaldava testitava materjali ülaltoodud bioloogilise keskkonna variandile saab arsti otsusega määrata korraga mitu võimalust, sealhulgas:

• määrima(eritumine suguelunditest);
• limaskestalt kraapimine(suu, nina, suguelundid);
• sülg, röga või pleura vedelik;
• eesnäärme mahl, eesnäärme sekretsiooni uurimine kahjuri esinemise kohta;
• platsenta kude või lootevesi;
• üldine uriinianalüüs sette uurimiseks (pärast tsentrifuugimist), vajadusel Mycobacterium tuberculosis'e tuvastamiseks;
• tserebrospinaalvedelik kesknärvisüsteemi nakkuslike kahjustuste tuvastamiseks;
• rakkude või kudede kogumine(biopsia) maksast, kaksteistsõrmiksoolest, maost jne.

Need proovid asetatakse spetsiaalsesse reaktorisse ja analüüsitakse uuritud DNA fragmentide korduva kahekordistamisega (amplifitseerimisega), korduvate replikatsiooni- ja denaturatsioonitsüklitega, lisades sünteesiks spetsiifilisi ensüüme. Vastavalt ahelreaktsiooni tüübile tuvastab see meetod DNA või RNA tüübi ja individuaalsed omadused. Lõppkokkuvõttes PCR-protsess võrdlev analüüs kloonitud geneetiline materjal võimaldab tuvastada isegi üksikuid elusviiruse rakke, eristades kergesti ureaplasma mükoplasmast või.

PCR-diagnostika eelised ja puudused

Sellel PCR-diagnostikal on nii eeliseid kui ka mitmeid puudusi.

Diagnostika eelised:

• patogeeni määratlus näitab otseselt DNA või RNA ebatüüpilise lõigu olemasolu geneetilises materjalis;
• PCR diagnostika annab 100% täpsuse tänu ainult konkreetsele viirusele või bakterile iseloomulike nukleiinhappeosakeste (DNA või RNA fragmentide) esinemisele uuritavas materjalis;
• PCR-süsteemi kõrge tundlikkus võrreldes teiste diagnostikameetoditega. PCR analüüsist patogeeni olemasolu kindlakstegemiseks piisab elusviiruse ühe raku jaoks (10-100 rakku proovis), mis võimaldab tuvastada patogeenset mikroorganismi haiguse varases staadiumis raskete sümptomite puudumisel. , ja täiustatud vormides;
• kõrgtehnoloogiline automatiseeritud PCR-amplifikatsioon suurendab analüüsi kiirust, testides proovi võtmise päeval (eraldades diagnoosimiseks mitte rohkem kui 4-6 tundi). See suurendab tootlikkust ja annab paremuse kultuuri uurimismeetoditest;
• analüüsi mitmekülgsus võimaldab mitmel viisil võetud DNA või RNA geneetilise materjali abil tuvastada ühest bioloogilisest proovist mitu patogeeni.

Puudustest rääkides, siis, arvestades PCR-süsteemi tundlikkust, on üks ebameeldivatest hetkedest:

• mikroorganismide varieeruvus. Puuduseks on see, et mikroorganismidele on omane mutatsioon, mis viib patogeeni uuritud genotüübi muutumiseni. Ja PCR-testisüsteem genoomi amplifitseeritud piirkonnas ei suuda kinni püüda juba areneva patogeeni hübriidi, nii nagu inimese immuunsüsteem ei tunne seda ära, nii ei reageerita ka nakkushaiguse olemasolu kindlakstegemisele. Kuid selleks on käimas mitmesugused arendused PCR-meetodi täiustamiseks;
• võimalus saada valepositiivne või valenegatiivne tulemus. Selleks, et PCR-diagnostika ühes etapis ei tekiks valetulemusi, tuleb see läbi viia hoolikalt, protsessi rikkumata, järgides materjali võtmise reegleid. Proovid võivad muuta oma struktuuri või isegi laguneda, mis võib viia vale negatiivse või valepositiivse tulemuseni. Tuleb mõista, et selline tulemus võib olla siis, kui nakkus on juba tapetud, kuid surnud rakkudel pole olnud aega end uuendada ja neid võeti kloonimisel arvesse. Seetõttu edasi varajased kuupäevad pärast ravi kasutatakse muid meetodeid (näiteks) ja pärast mitteaktiivsete patogeenide täielikku eemaldamist organismist viiakse läbi analüüs-kontroll PCR abil. Ja juba teeb raviarst lõpliku otsuse ravi asjakohasuse kohta, võttes arvesse kõiki argumente "poolt" ja "vastu".

Ettevalmistus PCR diagnostikaks ja testimise tingimused

Tasub pöörata tähelepanu lihtsale PCR-i ettevalmistamisele, selleks on vaja rangelt järgida kõiki raviarsti soovitusi ja täpsema tulemuse saamiseks järgida vähemalt mõnda vaieldamatut tingimust.

Sõltuvalt uuritava materjali proovivõtu meetodist tuleb meeles pidada, et:

• venoosse verega diagnostikaks patsienti tuleb testida tühja kõhuga, välistades isegi vedeliku kasutamise;
• määrima seksuaalsest kontaktist on vaja hoiduda vähemalt paar päeva, suguelundite hügieen on lubatud läbi viia õhtul, kuid mitte katsepäeval. Uuringu jaoks tasub valida optimaalne aeg, võttes arvesse: kaks päeva enne või pärast menstruaaltsüklit;
• mis tahes proovivõtumeetodi puhul peaks paar nädalat enne sünnitust lõpetama antibakteriaalsete ravimite kasutamise ravimid, olles eelnevalt konsulteerinud oma arstiga, kuna see võib mõjutada tulemuse usaldusväärsust;
• uriinianalüüsi jaoks patogeenide esinemise kindlakstegemiseks on vaja mitte ainult jälgida steriilsust ja hügieeni, vaid ka kogutud materjali kvaliteeti uurimistööks, mis kannab täpsemat teavet. Seetõttu on vastuvõetav oodata 2-3 tundi viimasest urineerimisest kuni uriini kogumiseni või kasutada hommikust proovi, mis annab suurema tõenäosuse põletikulise protsessi esinemiseks.

PCR kasutamine ja avastatud haigused

Paljude haiguste tekitajate otsimisel ei tohiks ülaltoodud soovitusi eirata ning arsti määratud läbivaatus PCR-diagnostika meetodil võib kaitsta tõsiste tüsistuste eest mitte ainult täiskasvanut, vaid ka väikest, veel sündimata last emakas. .

Tõepoolest, just naissoost pool elanikkonnast kannatab kõige sagedamini teatud tüüpi viiruste (HPV) all, mis suurendab oluliselt emakakaelavähi või viljatuse võimalust. Ja seda võimalust silmas pidades negatiivne mõju raseduse kulgu ja loote arengut silmas pidades tuleb meeles pidada, et erinevaid sugulisel teel või immuunpuudulikkusega mikroorganismide rühmi on raske seostada ühe või teise patogeeni rühmaga, kuna need on omavahel väga seotud (näiteks , TORCH infektsioonid ja STI-d). Kuid polümeraasi ahelreaktsioon suudab leida võõra struktuuri, määrates naise kehas viiruse DNA spetsiifilise tüübi.

Analüüsi tulemuste dešifreerimine võimaldab teil haiguste esinemist kinnitada või ümber lükata. Selline analüüs, mis hõlmab paljusid patogeene, on väga asjakohane paljude nakkuste õigeaegseks avastamiseks, näiteks:

• HIV-nakkuse tuvastamine. Immuunsuse tõsine kahjustus infektsiooni tõttu, mis mõjutab peamiselt immuunsüsteemi CD4 retseptorite pinnal olevaid immuunkompetentseid rakke, mis seejärel kaotavad oma võime kaitsta end infektsioonide eest ja lakkavad reageerimast viiruse RNA olemasolule vereplasmas. Anonüümsel läbivaatusel positiivse tulemuse korral korratakse seda täiendavate uuringute lisamisega;
• viirushepatiit, kõige sagedamini C-hepatiit(sisaldab RNA patogeeni), mida oma kerge taluvuse tõttu on raske teiste meetoditega diagnoosida, kuna PCR meetod on optimaalsem patogeeni tuvastamiseks verest või maksa biopsiast. avaldub hilises staadiumis, moodustades pahaloomulise põletikulise protsessi. Siiski tasub arvestada, et kui vere antikehade olemasolu testi (AT) tulemus on positiivne ja PCR-test annab negatiivse tulemuse, võib see viidata viiruse esinemisele organismis väike kogus või mõjutatud rakud on maksarakkude genoomis ootel, ilma vereringele juurdepääsuta. Sellistel juhtudel viiakse lõpliku diagnoosi ja ravimeetodite määramiseks läbi mitmeid korduvaid uuringuid;
• onkogeensed viirused nagu HPV(inimese papilloomiviirus), millel on üle 100 erinevat tüüpi sugulisel teel või meditsiiniliste protseduuride käigus leviv viirus, vastsündinu nakatub sünnikanali kaudu emalt, kui ta on papilloomiviiruse nakkuse kandja;
• STI(sugulisel teel levivad infektsioonid);
• sobib kõikide suguhaiguste tuvastamiseks(, gardnerelloos,) ja TORCH infektsioonid;
• näitab suure täpsusega kellel on mononukleoosi infektsioon, mida iseloomustab lümfi- ja retikuloendoteliaalsüsteemi kahjustus (suurenenud lümfisõlmed, põrn, maks), saab tuvastada PCR diagnostika abil, võttes uuritava materjalina vereseerumit. Filatovi tõbi võib väliste parameetrite järgi avalduda lööbe, sapisusena nahka, valge katt keelel.
• , tungides immuunsüsteemi pärssivate ravimite kasutamisega AIDS-i patsientide ja elundisiirdamise saajate verre;
• herpeetiline infektsioon, mis esindab üht või teist tüüpi herpese, mis võib mõjutada suguelundeid, silmade limaskesta või nahka;
• tuberkuloos. Haiguse peamiste sümptomite esinemisel määratakse pärast bronhoskoopia tulemuste saamist PCR-analüüs, mis võimaldab teil tuberkuloosi aktiivset staadiumi diagnoosida palju kiiremini kui bakterioloogilise või bakterioskoopilise meetodi abil;
• viiruslikud nakkushaigused nagu puukentsefaliit(borrelioos). Iseloomustab rakukahjustus närvisüsteem, mürgistus, ajupõletik ja seejärel halvatus. Antigeeni tuvastamiseks PCR-diagnostika abil võetakse RNA viiruse eraldamiseks verd ja tserebrospinaalvedelikku.
• Helicobacter pylori infektsiooni tuvastamine(viib kroonilise gastriidi, peptilise haavandi, mao kasvajateni) PCR-diagnostika abil võimaldab tuvastada Helicobacter pylori DNA-d (geneetiline materjal) biopsias, väljaheites, süljes, eristades tüvesid pahaloomulisuse astme järgi.

Infektsioonide PCR-diagnostika areneb kiirendatud tempos ning seda kasutatakse edukalt onkoloogias, günekoloogias, uroloogias, gastroenteroloogias, viroloogias ning loetelu täieneb pidevalt, kuid ei piirdu ainult nakkushaiguste patogeenide otsimisega. PCR-meetodi muudest praktilistest rakendustest võib välja tuua ka uuringute kasutamise isaduse tuvastamiseks ja isiku tuvastamiseks.

PCR-diagnostika on polümeraasi ahelreaktsioonil põhinev tehnika, mille abil saab inimest uurida nakkus- ja pärilike haiguste suhtes. 12 infektsiooni PCR analüüsid näitavad tulemust olenemata sellest, kas haigus on äge või krooniline. Mõned eksperdid peavad PCR 12 kohustuslikuks analüüsiks ja ilma selleta ei pane lõplikku diagnoosi. Tulemused võivad olla positiivsed isegi kaua enne haiguse sümptomite ilmnemist.

20. sajandil avastas Cary Mullis USA-st polümeraasi ahelreaktsiooni fenomeni. Praegu on PCR-meetod mõnes meditsiinivaldkonnas kullastandard. Meetod on kõige tõhusam haiguse avastamiseks aktiivses staadiumis, kuna on juhtumeid, kus tavapärased meetodid ei anna aktiivses staadiumis nii täpset tulemust.

Nakkuslike protsesside diagnoosimine PCR-i abil on üsna asjakohane kaasaegne maailm. Seda tüüpi uuringu eelised on järgmised:

1. Nakkustekitaja tuvastamine analüüsides. Analüüs hõlmab nakkustekitaja DNA või RNA tuvastamist.
2. Valed ja ekslikud reaktsioonid on praktiliselt välistatud.
3. PCR-meetod 12 on kõige tundlikum. Tänu sellele meetodile saab tuvastada isegi üksikuid nakkusetekitajate rakke.
4. Varjatud patogeenide PCR tulemus on valmis 4 tunni jooksul pärast protseduuri.
5. Võimalus tuvastada nakkustekitajaid ilma haigusele iseloomulike sümptomite puudumiseta. Meetod on konkreetse haiguse korral üsna tõhus.

Kaasaegses maailmas areneb infektsioonide PCR-diagnostika kiirendatud tempos. Tehnikat täiustatakse aktiivselt. Ilmuvad uued sordid PCR uuringud. Tänu arengule seda meetodit läbivaatuse käigus muutub see võimalikult paljudele inimestele kättesaadavaks, samas kui hind muutub järk-järgult.

Polümeraasi ahelreaktsiooni alus

PCR meetod viiakse läbi eranditult laboris. Selle rakendamiseks kasutatakse spetsiaalseid ensüüme, mis suurendavad mitu korda patsiendi DNA ja RNA struktuuri. Selline kogus DNA-d ja RNA-d tuleks moodustada, et oleks võimalik teostada visuaalset analüüsi. Uuringu käigus kopeeritakse RNA või DNA lõigu koopia, mis sobib ideaalselt nõutavate tingimustega.

Laboratoorium peab andmebaasi, kus on kirjas erinevate nakkusetekitajate täpne struktuur. Tänu PCR-meetodile saate mitte ainult näha patogeeni, vaid ka arvutada selle kvantitatiivse suhte.

PCR-diagnostika hõlmab ka teatud uuendusi, mille hulgas võib eristada järgmist:

• mutatsioonide sisseviimine;
• üksikute DNA fragmentide ühendamine;
• isaduse määramine jne.

PCR analüüsiga tuvastatud infektsioonid

PCR-diagnostika võimaldab tuvastada järgmisi nakkusprotsesse:

• järgmiste sortide hepatiit: A, B, C, G;
• Epstein-Barri viirus, nakkusliku mononukleoosi põhjustaja;
• tsütomegaloviirus;
• mycobacterium tuberculosis;
• herpes 1 ja 2 tüüpi;
• paljud sugulisel teel levivad infektsioonid: ureaplasmoos, gardnerelloos, klamüüdia, mükoplasmoos, trihhomoniaas.
• HPV ja selle onkogeensed alamliigid;
• puukentsefaliit ja borrelioos;
• Candida infektsioon;
• listerioos;
• Helicobacter pylori infektsioon.

Ja need on vaid mõned kõige levinumad infektsioonid, mida saab PCR abil tuvastada. PCR-i vereanalüüsi kasutatakse aktiivselt meditsiinipraktika günekoloogilises valdkonnas, aga ka sellistes valdkondades nagu:

• pulmonoloogiline;
• ftisiaatriline;
• gastroenteroloogiline;
• onkoloogiline;
• paljud teised meditsiiniharud.

Analüüsiks materjali kogumise reeglid

Võõrast DNA-d ja RNA-d saab tuvastada, kui uurida konkreetse inimese erinevaid kehavedelikke. Inimese uurimiseks teatud sugulisel teel levivate nakkuste esinemise suhtes on vaja võtta patsiendi suguelundite eraldumise proov (määrimine või kraapimine) ja tema uriinist.

Kui tekib vajadus uurida inimest mitmesuguste infektsioonide (HIV, herpes, hepatiit jt) suhtes, tehakse PCR analüüs, mille jaoks kasutatakse patsiendi verd.

Herpeetilise kahjustuse, mononukleoosi diagnoosimiseks peate võtma patsiendi suuõõne määrdumise. CMVI kinnitamiseks võetakse patsiendi uriin analüüsiks. On juhtumeid, kui tserebrospinaalvedelikku uuritakse, et selgitada välja tekkinud neuroloogiliste kõrvalekallete põhjused.

Samal ajal uurib pulmonoloog PCR meetodil konkreetse patsiendi röga ja vedelikku pleurast.

Kui vastsündinud lapsel on emakasisese infektsiooni kahtlus, võtavad arstid rasedalt naiselt lootevee ja platsentakoe tüki analüüsi.

Analüüsi esitamine: protseduuri tunnused ja tulemuste tõlgendamine

Kõik PCR-meetodil uuritud patsiendid saavad kõige usaldusväärsema tulemuse. Sel juhul on vigade esinemine praktiliselt välistatud. Selle analüüsi tulemused koostatakse piisavalt kiiresti, mis hõlbustab diagnoosimist ja tagab terapeutiliste meetmete õigeaegse määramise.

PCR-i tulemuse usaldusväärsus sõltub otseselt uuritava materjali kohaletoimetamise õigsusest. Materjal ei tohi olla saastunud, vastasel juhul ei ole uuringu tulemus objektiivne. Kõige olulisemad soovitused enne PCR-testi võtmist hõlmavad järgmisi nõudeid:

1. Päev enne analüüsi on seksuaalne tegevus keelatud.
2. Infektsioonide vereanalüüs tuleb võtta hommikul tühja kõhuga.
3. Uriini manustatakse hommikul steriilses anumas.

Analüüsi tulemus on valmis 1,5-2 päeva pärast kõnealust protseduuri. On olukordi, kus tulemuse saab valmis teha samal päeval.

Tulemuste dešifreerimine

Seda tüüpi uuringu tulemus võib olla positiivne või negatiivne. Vereanalüüsi negatiivne tulemus näitab, et esitatud materjalis ei ole nakkusohtlikke elemente. Suur hulk tehtud PCR-teste näitab negatiivset analüüsi.

Positiivne PCR analüüs kinnitab tõsiasja, et esitatud materjalist leiti nakkustekitajad ning vajalik on patsiendi kvaliteetne ja tõhusaim ravi.

Tulemus võib olla positiivne, kuid haiguse ilminguid pole. See näitab kas haiguse algust või selle kandumist. Kui tuvastatakse haiguse kandja, ei ole terapeutilisi meetmeid vaja. Peate lihtsalt pöörduma spetsialisti poole. Selliste haiguste näideteks on:

• papilloomiviiruse infektsioon;
• herpes jne.

Tavaliselt leidub neid süljes, emakakaela kanali kraapides, kusitis. Siiski tuleb meeles pidada, et haige inimene võib nakatada absoluutselt terveid inimesi, hoolimata asjaolust, et see haigus teda kuidagi ei häiri. Haigus võib muutuda krooniliseks. Tuleb märkida, et juhtudel, kui PCR-i vereanalüüs näitas positiivne tulemus, terapeutiliste meetmete määramine on lihtsalt vajalik.

PCR analüüsil on ka kvantitatiivne omadus. Kvantitatiivset tulemust hindab ainult spetsialist, see on erinevate infektsioonide puhul individuaalne. Kvantitatiivsete näitajate põhjal saab arst mõista, kui aktiivne see patoloogiline protsess on, et määrata konkreetse haiguse täpne arengustaadium. Saadud tulemusi analüüsides saab spetsialist valida vajaliku ravimi ja võimalusel ravimi annust uuesti läbi vaadata.

PCR diagnostika täpsus

Spetsialistidele antakse PCR 3 kõige olulisemat omadust, mille hulgas on:

1. Täpsus.
2. Spetsiifilisus.
3. Tundlikkus.

Infektsioonide diagnoosimisel PCR-iga on nakkusetekitajate tuvastamise tõenäosus suur. Vere ja muude vedelike PCR-analüüs on väga spetsiifiline. Tema abiga saate hõlpsalt tuvastada konkreetse nakkusprotsessi. PCR-diagnostika on väga tundlik. Kui uuritav materjal sisaldab minimaalses koguses nakkustekitajaid, on PCR-meetod alati positiivne.

Kõige harvem on valepositiivne tulemus. Kui nakkust pole, on tulemus negatiivne.

PCR latentse nakkusprotsessi jaoks

Kui inimesel kahtlustatakse STI-d, määratakse varjatud infektsioonide vereanalüüs. Seksuaalhaigusi saab avastada ainult patsiendi uurimisel. Sellised haigused nagu:

• klamüüdia;
• ureaplasmoos;
• gonorröa;
• herpes;
• gardnerelloos;
• mükoplasma.

Ülaltoodud seksuaalinfektsioonid on üsna tavalised ja samal ajal salakavalad. Haiguse arengu algfaasis ei anna nad eredaid sümptomeid ja patsiendid ei otsi abi. Nende infektsioonide kahtluse korral on vajalik PCR-vereanalüüs, ureetra ja emakakaela kanali limaskesta kraapimine.

STI-del on väga negatiivne mõju reproduktiivsüsteem. Need võivad põhjustada loote viljatust või väärarenguid. Sellega seoses peate enne raseduse planeerimist tegema PCR-testi.

Populaarne on 12 infektsiooni PCR. Diagnoos PCR 12 abil viiakse läbi genitaalidest tampooni kohaletoimetamise teel. Materjal võetakse 2 tundi pärast urineerimist. 2 päeva enne uuringut ei tohi suposiite tuppe sisestada ega douchingut teha. Analüüsi tulemus on valmis 2 päeva pärast.

PCR-i maksumus varieerub sõltuvalt uuritavast infektsioonist. Hind on vahemikus 200 kuni 500 rubla iga infektsiooni kohta. Eralaborisse saab siseneda ja end läbi vaadata saab iseseisvalt, ilma arsti saatekirjata.

Polümeraasi ahelreaktsioon on tuntud juba 30 aastat. Seda kasutatakse laialdaselt paljudes valdkondades, alates arheoloogiast kuni geneetikani.

Just PCR meetod aitab isadust tuvastada, kuid kõige sagedamini kasutatakse seda erinevate inimorganismi nakkushaiguste tuvastamiseks.

Kuidas PCR-analüüsi tehakse ja mis see on? Püüame neile küsimustele üksikasjalikult vastata.

PCR analüüs - mis see on?

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on ülitäpne molekulaargeneetilise diagnostika meetod, mis võimaldab avastada inimesel erinevaid nakkus- ja pärilikke haigusi nii ägedas kui kroonilises staadiumis ning ammu enne haiguse avaldumist.

PCR-meetod on absoluutselt spetsiifiline ja õigesti teostatuna ei saa anda valepositiivset tulemust. See tähendab, et kui nakkust pole, siis analüüs ei näita kunagi, et see on. Seetõttu tehakse nüüd väga sageli diagnoosi kinnitamiseks täiendav PCR analüüs patogeeni ja selle olemuse kindlakstegemiseks.

Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) töötas 1983. aastal välja Cary Mullis (USA), mille eest ta pälvis 1993. aastal Nobeli preemia keemia vallas.

Mis on selle meetodi eelis?

Selle meetodi abil diagnoosimine võimaldab teil leida patogeeni otse uuritud materjalides sisalduvas geenis. See on kõige täpsem analüüs seksuaalsete infektsioonide, varjatud infektsioonide, erinevate sugulisel teel levivate haiguste kohta.

Erinevused PCR-diagnostika ja muude laboratoorsete uurimismeetodite vahel on järgmised:

• meetod on suunatud patogeeni enda tuvastamisele;
• diagnostika PCR abil on mitmekülgne: mitmete patogeenide tuvastamiseks;
• haigused, piisab ainult ühest patsiendi bioloogilisest proovist;
• meetod on väga tundlik ja sellega ei kaasne muid ristreaktsioone.

Lisaks on PCR diagnostika eeliseks see, et analüüsiks sobib patsiendi igasugune bioloogiline materjal: veri, eritised suguelunditest, uriin, sperma.

Milliseid infektsioone saab PCR-määrdiga tuvastada?

Kehal võib olla suur hulk infektsioonide põhjustajad, see hõlmab "peidetud", mis ei avaldu pikka aega.

PCR-määrimise analüüs võimaldab selliseid nakkusi tuvastada:

• suguelundite ureplasmoos;
• kandidoos ();
• herpes;
• vähirakkude olemasolu;
• hinnata hormonaalset seisundit;

PCR jaoks uuritav materjal on tavaliselt röga, sülg, uriin, veri. Enne analüüsi läbiviimist on vaja seda hoolikalt ette valmistada, olles eelnevalt konsulteerinud arstiga.

Veri PCR jaoks annetatakse tavaliselt tühja kõhuga. Häid tulemusi näitab analüüs, kui materjal uuringuks võetakse emakakaelakanalist või kusiti. Sel juhul on kõige parem teha PCR diagnostika hiljemalt üks päev pärast vahekorda.

PCR-i sordid

PCR-i kasutatakse paljudes valdkondades analüüsiks ja teaduslikeks katseteks. On erinevaid analüüsimeetodeid:

1. pöördtranskriptsiooni PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR (inglise)) – kasutatakse teadaoleva järjestuse amplifitseerimiseks, isoleerimiseks või identifitseerimiseks RNA raamatukogust.
2. Pööratud PCR(Inverse PCR (inglise)) - kasutatakse juhul, kui soovitud järjestuses on teada vaid väike ala. See meetod on eriti kasulik, kui on vaja määrata naaberjärjestused pärast DNA sisestamist genoomi.
3. Pesastatud PCR-i kasutatakse reaktsiooni kõrvalproduktide arvu vähendamiseks. Kasutage kahte paari praimereid ja viige läbi kaks järjestikust reaktsiooni.
4. Asümmeetriline PCR(inglise Asymmetric PCR) - viiakse läbi, kui on vaja amplifitseerida peamiselt ühte algse DNA ahelatest. Kasutatakse mõnes sekveneerimis- ja hübridisatsioonianalüüsi tehnikas.
5. Kvantitatiivne PCR(Kvantitatiivne PCR, Q-PCR (inglise)) või reaalajas PCR – kasutatakse konkreetse PCR produkti koguse mõõtmise otseseks jälgimiseks igas reaktsioonitsüklis.
6. Stepped PCR (Touchdown PCR (inglise)) – seda lähenemist kasutades väheneb praimerite mittespetsiifilise seondumise mõju.
7. Grupispetsiifiline PCR(inglise rühmaspetsiifiline PCR) – PCR seotud järjestuste jaoks ühes või nende vahel erinevad tüübid kasutades nende järjestuste jaoks konservatiivseid praimereid.

Kui matriitsi nukleotiidjärjestus on osaliselt teada või üldse teadmata, võib kasutada degenereerunud praimereid, mille järjestus sisaldab degenereerunud positsioone, milles võivad paikneda mis tahes alused. Näiteks võib praimeri järjestus olla: …ATH… kus H on A, T või C.

Milliseid bioloogilisi materjale uuritakse?

PCR-uuringute materjaliks võivad olla erinevad bioloogilised söötmed ja inimvedelikud, millest saab tuvastada bakteri võõr-DNA või viiruse DNA või RNA:

1. Uriin. Seda saab kasutada urogenitaaltrakti nakkuslike kahjustuste korral meestel ja kuseteede organite puhul naistel (meestel asendab uriini kasutamine materjalina epiteeli kraapimist).
2. Flegm. Seda kasutatakse tuberkuloosi ja harvemini klamüüdia ja mükoplasmoosi hingamisteede vormide diagnoosimiseks. Röga kogus 15-20 ml kogutakse steriilsesse (ühekordselt kasutatavasse) viaali.
3. bioloogilised vedelikud. Vastavalt näidustustele võetakse eesnäärmemahla, pleura-, tserebrospinaal-, lootevett, liigesevedelikku, bronhoalveolaarloputust, sülge.
4. Epiteeli kraapimine limaskestadelt. Tavaliselt kasutatakse sugulisel teel levivate haiguste (STD) diagnoosimiseks, nagu gonorröa, klamüüdia, mükoplasmoos, ureaplasmoos, trihhomonoos, gardnerelloos, herpeedilised ja muud limaskestad mõjutavad infektsioonid.
5. Biopsiad. Kõige sagedamini kasutatakse Helicobacter pylori infektsiooni tuvastamiseks mao ja kaksteistsõrmiksoole biopsia proove.
6. Veri, plasma, seerum. Kasutatakse hepatiit B, C, D, G viiruste, herpese, CMV, HIV, inimese geenide PCR analüüsiks.

Kuidas analüüsiks valmistuda?

PCR-i tulemuse usaldusväärsus sõltub otseselt uuritava materjali kohaletoimetamise õigsusest. Materjal ei tohi olla saastunud, vastasel juhul ei ole uuringu tulemus objektiivne. Kõige olulisemad soovitused enne PCR-testi võtmist hõlmavad järgmisi nõudeid:

1. Uriini manustatakse hommikul steriilses anumas.
2. Infektsioonide vereanalüüs tuleb võtta hommikul tühja kõhuga.
3. Päev enne testi ei tohiks olla seksuaalselt aktiivne.

Analüüsi tulemus on valmis 1,5-2 päeva pärast kõnealust protseduuri. On olukordi, kus tulemuse saab valmis teha samal päeval.

PRP analüüsi dešifreerimine

Esitatud uurimuse tõlgendamise protsess paistab silma oma lihtsuse poolest. tulemused pcr analüüs saab kätte 1,5-2 päeva jooksul peale materjali tarnimist. Mõnel juhul on tulemus valmis juba esimesel päeval ja see võib tähendada järgmist:

• Negatiivne tulemus näitab, et diagnoositav materjal ei sisalda soovitud nakkustekitajat.
• PCR positiivne näitab, et inimese kehas on patogeeni DNA või RNA.

Mõnel juhul tehakse mikroorganismide kvantitatiivne määramine. See kehtib eriti oportunistlike patogeenide põhjustatud haiguste puhul. Kuna need bakterid avaldavad oma negatiivset mõju ainult siis, kui neid on liiga palju.

Samuti on kvantitatiivne PCR analüüs oluline ravitaktika valikul ja viirusnakkuste, nagu HIV ja hepatiidi viiruste, ravi jälgimisel.

Kui täpne on PCR infektsioonide diagnoosimisel?

PCR-meetodit iseloomustab kõrge täpsus, spetsiifilisus ja tundlikkus. See tähendab, et see analüüs on võimeline:

• täpselt kindlaks määrata nakkuse olemasolu või puudumine;
• täpsustage täpselt, millise infektsiooniga on tegemist (spetsiifilisus);
• tuvastada infektsiooni isegi väga väikese mikroobse DNA sisaldusega bioloogilises materjalis,
• mida on testitud (tundlikkus).

PCR analüüs: hind ja tingimused

Konkreetse analüüsi hind sõltub sellest, millise infektsiooni suhtes teid testitakse. Ligikaudsed hinnad ja tingimused:

1. STI: 300-500 rubla, tähtajad - 1 päev;
2. Epstein-Barri viirus, inimese papilloomiviirus, herpes, tsütomegaloviirus: 300-500 rubla, terminid - 1 päev;
3. Hepatiit A, B, C, D, G: kvalitatiivne analüüs 650 rubla, kvantitatiivne analüüs 2000 rubla. Tingimused - kuni 5 päeva;
4. C-hepatiidi viiruse antikehad, kokku (Anti-HCV) - 420 rubla;
5. C-hepatiidi viiruse antikehad, IgM (Anti-HCV IgM) - 420 rubla;
6. Helicobacter pylori (Helicobacter pylori): 300-400 rubla, tähtajad - 1 päev;
7. HIV (antikehad ja antigeenid) - 380 rubla;
8. HIV RNA, kvalitatiivselt - 3500 rubla;
9. HIV RNA, kvantitatiivselt - 11 000 rubla.

Raha säästmiseks saate valida fikseeritud analüüside paketi. Seda teenust pakuvad enamik kliinikuid, kus saate teha analüüsi PRC meetodil (in vitro, onclinic jne).