Защо се прави PCR диагностика в пулмологията. Полимеразна верижна реакция (PCR) - метод с висока точност при откриване на специфични инфекциозни агенти

PCR диагностика - какво е това? Същността на полимеразната верижна реакция се състои в това, че за изследване на биологичен материал се използват маркери от специален тип, които бързо анализират ДНК на инфекциозни агенти. В гинекологията има различни методи за PCR анализи при жени в зависимост от материала, който се изследва (кръв, урина, намазки и др.). След обработка на данните се открива видът на патогена (това е така нареченият "PCR качествен анализ") и / или тяхната концентрация - този тип изследване се нарича " PCR количественанализ“.

Предоставянето на анализи чрез PCR ви позволява бързо да проверите за патогени на инфекциозна патология, когато не е възможно да направите това с други анализи (имунологични, бактериологични, микроскопски). В съвременната лабораторна диагностика PCR е най-ефективният и По най-добрия начиноткриване на ДНК на микроби и вируси. Тестът позволява на гинеколога и други лекари на клиниката не само да определят причината за заболяването при жените и мъжете, но и да контролират хода на процеса, да оценят правилно резултата от терапията.

Цени за PCR диагностика

КАКВО ПОКАЗВА PCR

Качествен PCR анализпоказва прякото присъствие на инфекциозния агент в човешкото или животинското тяло. Можете да преминете както цитонамазка от почти всяка локализация (гениталии, уретра, орофаринкс и т.н.), така и PCR кръвни тестове. Чрез намазка или изстъргване в гинекологията те проверяват за хламидия, урея- и микоплазми, херпесен вирус, HPV и други микроби. Резултатът от ДНК анализа се дава на пациента със заключение на лабораторията "открит" или "не е открит". В случай на кръвен тест, той ви позволява да идентифицирате ХИВ, хепатит, херпес, цитомегаловирус и други микроорганизми на ранен етап, а в някои случаи и да определите техния генотип и показва броя.

Количествени PCR анализи.
Изследването позволява не само бързо да се идентифицира желаният генетичен материал, но и да се покаже концентрацията на тяхната ДНК (количествен PCR метод). Определянето на вида и броя на патогените е важно при вземането на решение дали да се предпише лечение, особено ако се открие например микоплазма (количествено определяне на ДНК), типизиране на уреаплазма (количествено определяне на ДНК) или, най-важното, определянето на генотип и количественото определяне на вирусния товар може да се прави в анализи за HPV инфекция.

PCR РЕЗУЛТАТИ

От всичко казано става ясно какво представлява PCR анализът и какви са предимствата на този тест в гинекологията. Друг важен нюансна тази диагностика - декодирането на резултата е достъпно и удобно за непрофесионалист. Като се има предвид колко PCR анализ се прави в клиниката, както и времето на заключението (лабораторията обикновено дава информация за 1-2 дни), този диагностичен метод се превръща в най-добрия избор за определяне на всички основни гинекологични и други инфекции.

Лабораторията с качествен метод за извършване на ДНК изследване на женски и мъжки цитонамазки прави заключения от два вида:

1. "PCR отрицателен" - не е открит патоген в тестовия материал и
2. "PCR положителен" - в теста е открита РНК или ДНК на микроб или вирус.

PCR в гинекологията

Показания за преминаване на тези тестове при жени са както следва:

• Подозрение за възможността за инфекция с ППИ;
• Анонимна анкета;
• Наличие на секрети от гениталния тракт, сърбеж;
• Болка в долната част на корема;
• Дискомфорт при уриниране;
• Болка по време на полов акт;
• Повишени левкоцити в анализа на цитонамазката за флора;
• Наличие на ерозия на шийката на матката;
• Планиране на бременност;
• Проблеми със зачеването и носенето на дете;
• Подготовка за гинекологични операции, IVF;
• За превантивни цели.

Къде е най-доброто място за вземане на PCR тестове в Москва?
Този вид диагностика в гинекологията се отнася до модерни и високотехнологични методи. PCR тестовете за инфекции трябва да се правят в клиника, която разполага с всичко необходимо за получаване на пълни резултати. В нашия медицински център материалът се взема от квалифицирани гинеколози с опит (а не от средностатистическия персонал в кабинета), използват се инструменти за еднократна употреба и специални лабораторни материали, а пробите, получени от пациенти, се изпращат на работа ежедневно. Това позволява не само бързо получаване на PCR резултати, но и гарантиране на тяхната надеждност. По желание - пълна анонимност на анкетата.

Колко струва PCR?
Тази услуга се предоставя от много медицински институции в столицата. Цената се влияе от много фактори, вариращи от местоположение до вътрешна ценова политика. Съществуват обаче обективни фактори, които определят средната минимална стойност, под която не може да бъде предоставена качествена и надеждна услуга поради посочените фактори. Цената на PCR диагностиката в московските клиники за някои инфекции е средно, както следва:

• качествен анализ на PCR цитонамазка - 400 - 500 рубли;
• количествен анализ на PCR намазка - от 600 рубли (1 единица);
• Диагностика на остъргване на РНК - от 1000 рубли (1 единица);
• PCR качествен кръвен тест (например за херпес, HPV, вирус на Epstein-Barr, цитомегаловирус) - 450 - 550 рубли, количествен - от 2000 рубли;
• Качествена ДНК на ХИВ (отричане / потвърждение на наличието на ХИВ в предклиничния период) - от 2000 рубли, количествена РНК - от 7000 рубли, резистентност - от 14 000 рубли.

Подготовка за PCR

За да получат правилни и надеждни резултати от изследването, момичетата и жените трябва да следват определени правила, преди да се изследват за инфекции:

1-2 дни преди посещението в клиниката за изследване, откажете сексуален контакт;
- въздържайте се от уриниране 1,5 - 2 часа преди цитонамазката;
- да извършва хигиена на външните гениталии с чиста вода, без перилни препарати, изключете промиването;
- изключете употребата на вагинални таблетки, супозитории;
- не вземайте PCR тестове по време на менструация;
- Тъй като сте девствена, преди прегледа, предупредете гинеколога за това предварително.

Как се правят PCR тестове

Преминаването на PCR в нашата клиника, включително анонимно, е доста просто. След това ще говорим за това как се взема PCR от жени и мъже и откъде, от кои места това изследване е най-информативно.

В случай на жена, анализът се взема от гинеколог. Това обикновено се случва при първия преглед при лекаря или когато просто се явите за изследване за инфекции, без предварителна консултация. Всичко по ваше желание. Казвате желанията си, за какви инфекции желаете да се изследвате и след това директно започва процедурата по вземане на материала. Пациентът се съблича под кръста, сяда на стола. След като раздели малките срамни устни, лекарят вмъква спекулум с подходящ размер във влагалището. Гинеколозите вземат PCR от жени, обикновено от шийката на матката, както и от уретрата. В последния случай, преди въвеждането на сондата, се извършва краткотраен масаж на уретрата с пръст, поставен във влагалището. В случай, че PCR анализът се прави от тийнейджърки или девици, тогава огледалото не се използва, а проби от секрети се вземат през дупка в химена или преддверието на влагалището. Полученият материал се поставя в запечатана епруветка със специална среда и се изпраща в лабораторията.

Приемането на този анализ при мъжете не е особено трудно. Сондата се вкарва в уретрата на дълбочина 3-4 см, завърта се няколко пъти по посока на часовниковата стрелка и обратно. Материалът също се поставя в епруветка за по-нататъшна диагностика.

Федерална агенция за образование

състояние образователна институция

Върховен професионално образование

"Карелска държавна педагогическа академия"

Курсова работа по темата:

Полимеразна верижна реакция (PCR) и нейното приложение

Изпълнено от: студент Корягина Валерия Александровна

Проверено от: Карпикова Наталия Михайловна

Петрозаводск 2013 г

Въведение

Глава 1 Преглед на литературата

1.5.4 Ефект на платото

1.5.6 Усилване

Заключение

Въведение

Последните двадесет години бяха белязани от широкото въвеждане на молекулярно-генетичните методи в биологичните, медицинските и селскостопанските науки.

До началото на 70-те години изглеждаше, че молекулярната биология е достигнала известна степен на съвършенство. През този период микроорганизмите са основният обект на молекулярно-генетичните изследвания. Преходът към еукариоти поставя изследователите пред напълно нови проблеми, които не могат да бъдат решени с помощта на методите за генетичен анализ, съществуващи по това време. Пробивът в развитието на молекулярната генетика стана възможен благодарение на появата на нов експериментален инструмент - рестрикционни ендонуклеази. През следващите години броят на методите за директен ДНК анализ, базирани на качествено различни подходи, започна бързо да нараства.

Съвременни технологиив много случаи се допуска повече дълбоко нивозапочнете да изучавате фината структурна и функционална организация на ядрените и извънядрените геноми на различни организми. Това беше от особено значение за разработването на нови методи за диагностика и лечение на различни заболявания. Не по-малко важна беше възможността за използване на постиженията на молекулярната генетика в популационната биология и развъждането за идентифициране и анализ на генетичната променливост на популации, сортове и щамове, идентифициране и сертифициране на икономически ценни индивиди, създаване на генетично модифицирани организми и за решаване на други проблеми.

Всеки метод има своите предимства и недостатъци. Няма универсален метод, който да разреши всички възникнали проблеми. Следователно изборът на конкретен метод за изследване е един от най-важните етапи на всеки научна работа.

Глава 1 Преглед на литературата

1.1 История на откриването на полимеразната верижна реакция (PCR)

През 1983 г. К.Б. Мълис и др. публикуват и патентоват метода на полимеразна верижна реакция (PCR), който е предопределен да има дълбоко въздействие върху всички области на изследване и приложение на нуклеинови киселини. Значението на този метод за молекулярната биология и генетика се оказва толкова голямо и очевидно, че седем години по-късно авторът е удостоен с Нобелова награда за химия.

В началото на използването на метода, след всеки цикъл на нагряване-охлаждане, към реакционната смес трябваше да се добави ДНК полимераза, тъй като тя беше инактивирана при висока температура, необходима за разделяне на веригите на ДНК спиралата. Реакционната процедура беше относително неефективна, изискваше много време и ензими. През 1986 г. методът на полимеразна верижна реакция е значително подобрен. Предложено е да се използват ДНК полимерази от термофилни бактерии. Тези ензими се оказаха термостабилни и успяха да издържат на много реакционни цикли. Използването им направи възможно опростяването и автоматизирането на PCR. Една от първите термостабилни ДНК полимерази е изолирана от бактерии Thermus aquaticusи именуван Taq- полимераза.

Възможността за амплифициране на всеки ДНК сегмент, чиято нуклеотидна последователност е известна, и получаването му след PCR в хомогенна форма и препаративно количество, прави PCR алтернативен метод за молекулярно клониране на къси ДНК фрагменти. В този случай не е необходимо да се прилагат сложни методологични техники, които се използват в генното инженерство при конвенционалното клониране. Развитието на PCR метода значително разшири методологичните възможности на молекулярната генетика, и по-специално на генното инженерство, дотолкова, че коренно промени и засили научния потенциал на много от нейните области.

1.2 Разновидности на полимеразна верижна реакция (PCR)

· Вложен PCR- използва се за намаляване на броя на страничните продукти от реакцията. Използвайте два чифта праймери и извършете две последователни реакции. Втората двойка праймери амплифицира ДНК региона в продукта от първата реакция.

· Обърнат PCR- се използва, когато е известна само малка област в желаната последователност. Този метод е особено полезен, когато е необходимо да се определят съседни последователности след вмъкване на ДНК в генома. За прилагането на инвертирана PCR се извършва серия от ДНК разрези с рестрикционни ензими<#"justify">праймер за полимеразна верижна реакция

· Групово-специфична PCR- PCR за роднини<#"center">1.3 Полимеразна верижна реакция

Открита в средата на 80-те години на миналия век, полимеразната верижна реакция (PCR) може да увеличи броя на копията на оригинална проба милиони пъти в рамките на няколко часа. По време на всеки цикъл на реакцията се образуват две копия от оригиналната молекула. Всяко от синтезираните ДНК копия може да служи като шаблон за синтеза на нови ДНК копия в следващия цикъл. Така многократното повторение на циклите води до експоненциално увеличаване на броя на копията. От изчисленията следва, че дори да има 30 цикъла, броят на копията на оригиналната молекула ще бъде повече от 1 милиард. Дори ако вземем предвид, че не всички ампликони се дублират по време на всеки цикъл, общият брой копия въпреки това е доста голяма цифра.

Всеки цикъл на полимеразна верижна реакция (PCR) се състои от следните стъпки:

· Денатурация - Повишаването на температурата кара двуверижната молекула на ДНК да се развие и да се раздели на две едноверижни;

· Отгряване - Понижаването на температурата позволява на праймерите да се прикрепят към комплементарни области на ДНК молекулата;

· Удължаване - Ензимът ДНК полимераза завършва комплементарната верига.

За амплификация на избрания фрагмент се използват два олигонуклеотидни праймера (семена), фланкиращи определена ДНК област. Ориентирани към грундове 3 - завършват един към друг и по посока на последователността, която трябва да се усили. ДНК полимеразата осъществява синтеза (завършването) на взаимно допълващи се ДНК вериги, започвайки с праймери. По време на синтеза на ДНК праймерите се вмъкват физически във веригата от новосинтезирани ДНК молекули. Всяка верига на ДНК молекула, образувана с помощта на един от праймерите, може да служи като шаблон за синтеза на комплементарна ДНК верига, използвайки другия праймер.

1.4 Провеждане на полимеразна верижна реакция (PCR)

Полимеразната верижна реакция се извършва в специални тънкостенни полипропиленови епруветки, съвместими по размер с използвания термоциклер (усилвател) ​​- устройство, което контролира температурните и времевите характеристики на етапите на полимеразната верижна реакция (PCR) .

1.5 Принцип на метода на полимеразна верижна реакция

Полимеразна верижна реакция (PCR) е in vitro метод за амплификация на ДНК, който може да изолира и умножи специфична ДНК последователност милиарди пъти в рамките на няколко часа. Възможността за получаване на огромен брой копия на една строго определена област на генома значително опростява изследването на съществуваща ДНК проба.

За провеждане на полимеразна верижна реакция трябва да бъдат изпълнени редица условия:

1.5.1 Наличие на редица компоненти в реакционната смес

Основните компоненти на реакционната (PCR) смес са: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, смес от нуклеотидни трифосфати (ATP, GTP, CTP, TTP), праймери (олигонуклеотиди), анализиран ДНК препарат, термостабилна ДНК полимераза. Всеки от компонентите на реакционната смес участва пряко в полимеразната верижна реакция (PCR), а концентрацията на реагентите пряко влияе върху хода на амплификацията.

· Tris-HCl - определя pH на реакционната смес, създава буферен капацитет. Активността на ДНК полимеразата зависи от pH на средата, така че стойността на pH пряко влияе върху хода на полимеразната верижна реакция. Обикновено стойността на pH е в диапазона 8 - 9,5. Високото pH се дължи на факта, че с повишаването на температурата pH на Tril-HCl буфера пада.

· KCl - концентрацията на калиев хлорид до 50 mm влияе върху хода на процесите на денатурация и отгряване, концентрацията над 50 mm инхибира ДНК полимеразата.

· MgCl 2- тъй като ДНК полимеразата е Mg 2+ - зависим ензим, тогава концентрацията на магнезиеви йони влияе върху активността на ензима (Mg 2+образува комплекси с NTP - именно тези комплекси са субстрат за полимераза). Високата концентрация води до увеличаване на неспецифичното усилване, а ниската води до инхибиране на реакцията, оптималната (за различни полимерази) е в областта от 0,5 - 5 mM. В допълнение, концентрацията на магнезиеви соли влияе върху хода на процесите на денатурация и отгряване - повишаване на концентрацията на Mg 2+причинява повишаване на температурата на топене на ДНК (т.е. температурата, при която 50% от двойноверижните ДНК вериги се разпадат на едноверижни вериги).

· NTP - нуклеотидните трифосфати са директни мономери на нуклеиновите киселини. За да се предотврати прекъсването на веригата, се препоръчва еднакво съотношение на четирите нуклеотидни трифосфата. Ниската концентрация на тези компоненти в реакционната смес увеличава вероятността от грешки при изграждането на комплементарната ДНК верига.

· Грундове - Най-оптимално е използването на грундове с разлика в точката на топене не повече от 2 - 4 о C. Понякога при продължително съхранение при температура 4 о С, или след голям брой замразяване - размразяване, праймерите образуват вторични структури - димери, намаляващи ефективността на PCR. Отстраняването на този проблем се свежда до инкубиране на водна баня (Т=95 о В) за 3 минути и последващо бързо охлаждане до 0o ОТ.

· ДНК препарати - количеството и качеството на ДНК препарата (матрицата) пряко влияе върху хода и параметрите на полимеразната верижна реакция. Излишната ДНК проба инхибира полимеразната верижна реакция (PCR). примеси различни вещества, които са в ДНК препарата, също могат да намалят ефективността на полимеразната верижна реакция (PCR): натриев ацетат, натриев хлорид, изопропанол, етанол, хепарин, фенол, урея, хемоглобин и др.

· ДНК полимераза - при използване на малко количество ДНК полимераза се наблюдава намаляване на синтеза на крайния продукт правопропорционално на размера на фрагментите. Излишъкът от полимераза 2-4 пъти води до появата на дифузни спектри и 4-16 пъти - неспецифични спектри с ниско молекулно тегло. Диапазонът на използваните концентрации е 0,5 - 1,5 единици активност по отношение на 25 µl от PCR сместа.

В допълнение към основните компоненти на PCR сместа се използват редица допълнителни вещества, които подобряват качествените и количествените показатели на PCR: ацетамид (5%) - повишаване на разтворимостта на основните компоненти; бетаин (натриева сол) - стабилизиране на ДНК полимераза, понижаване на точката на топене на ДНК, изравняване на точката на топене; говежди албумин (10-100 μg / ml) - стабилизиране на ДНК полимераза; диметилсулфоксид (1-10%) - повишаване на разтворимостта на основните компоненти; формамид (2-10%) - повишаване на специфичността на отгряването; глицерол (15-20%) - повишаване на термичната стабилност на ензима, намаляване на температурата на денатурация на ДНК проба; амониев сулфат - понижаване на температурата на денатурация и отгряване.

1.5.2 Цикъл и температура

Общият изглед на програмата за полимеразна верижна реакция (PCR) е както следва:

сцена. Продължителна първична денатурация на ДНК препарата.1 цикъл

сцена. Бърза денатурация на ДНК препарата. Грунд отгряване. Удължение.30 - 45 цикъла.

сцена. Продължително удължаване. Охлаждане на реакционната смес 1 цикъл.

Всеки елемент от етапа - денатурация, отгряване, удължаване - има индивидуални температурни и времеви характеристики. Параметрите на температурата и времето на протичане на всеки елемент се избират емпирично, в съответствие с качествените и количествени показатели на продуктите на амплификацията.

Денатурация. По време на даден елементПолимеразната верижна реакция разделя двуверижна ДНК молекула на две едноверижни. Температурните параметри на денатурация са в диапазона 90 - 95 о С, но в случай на ДНК проба с високо съдържание на гуанин и цитозин, температурата трябва да се повиши до 98 о C. Температурата на денатуриране трябва да е достатъчна за пълно денатуриране - разцепване на ДНК веригите и избягване на "внезапно охлаждане" или бързо отгряване, но термостабилната ДНК полимераза е по-малко стабилна при високи температури. По този начин изборът на оптимални температурни параметри на денатурация за съотношението праймер/проба (приготвяне на ДНК) е важно условие за амплификация. Ако температурата на денатурация в първия етап е над 95 о C, се препоръчва да се добави ДНК полимераза към реакционната смес след първична денатурация. Продължителността на този елемент от етапа по време на полимеразната верижна реакция (PCR) трябва да бъде достатъчна за пълна денатурация на ДНК, но в същото време да не повлиява значително активността на ДНК полимеразата при дадена температура.

Отгряване. Температура на отгряване (Т а ) е един от най-важните параметри на полимеразната верижна реакция. Температурата на отгряване за всеки конкретен грунд се избира индивидуално. Зависи от дължината и нуклеотидния състав на праймера. Обикновено е по-ниска с 2 - 4 о От стойността на точката на топене (Т м ) грунд. Ако температурата на отгряване на системата е под оптималната, тогава броят на неспецифичните амплифицирани фрагменти се увеличава и, обратно, по-високата температура намалява броя на амплифицираните продукти. В този случай концентрацията на специфични ампликони може рязко да намалее, до инхибиране на полимеразната верижна реакция (PCR). Увеличаването на времето за отгряване също води до увеличаване на броя на неспецифичните ампликони.

Удължение. Обикновено всеки тип термостабилна ДНК полимераза има индивидуален температурен оптимум на активност. Скоростта на синтез на комплементарна ДНК верига от ензим също е стойност, специфична за всяка полимераза (средно тя е 30–60 нуклеотида в секунда или 1–2 хиляди бази в минута), така че времето за удължаване се избира в зависимост от вида на ДНК полимеразата и дължината на амплифицираната област.

1.5.3 Основни принципи на избор на грунд

При създаването на PCR тестова система една от основните задачи е правилният избор на праймери, които трябва да отговарят на редица критерии:

Грундовете трябва да са специфични. Особено внимание се обръща на 3 - краищата на праймерите, тъй като именно от тях Taq полимеразата започва да завършва комплементарната ДНК верига. Ако тяхната специфичност е недостатъчна, тогава е вероятно в епруветката с реакционната смес да се появят нежелани процеси, а именно синтез на неспецифична ДНК (къси или дълги фрагменти). Вижда се при електрофореза под формата на тежки или леки допълнителни ивици. Това затруднява оценката на резултатите от реакцията, тъй като е лесно да се обърка специфичен продукт на амплификация със синтезирана чужда ДНК. Част от праймерите и dNTPs се изразходват за синтеза на неспецифична ДНК, което води до значителна загуба на чувствителност.

Грундовете не трябва да образуват димери и бримки, т.е. не трябва да се образуват стабилни двойни нишки чрез отгряване на праймерите към самите тях или един към друг.

1.5.4 Ефект на платото

Трябва да се отбележи, че процесът на натрупване на специфични продукти на усилване експоненциално продължава само ограничено време, след което неговата ефективност спада критично. Това се дължи на така наречения ефект на "плато".

срочен ефект плато използвани за описване на процеса на натрупване на PCR продукти в последните цикли на амплификация.

В зависимост от условията и броя на циклите на реакцията на усилване, в момента на постигане на ефекта плато използването на субстрати (dNTPs и праймери), стабилността на реагентите (dNTPs и ензим), количеството инхибитори, включително пирофосфати и ДНК дуплекси, конкуренция за реагенти от неспецифични продукти или праймери-димери, концентрацията на специфичен продукт , и непълна денатурация при висока концентрацияпродукти за усилване.

Колкото по-ниска е първоначалната концентрация на таргетната ДНК, толкова по-висок е рискът от реакцията плато". Тази точка може да възникне преди броят на специфичните продукти на амплифициране да е достатъчен за анализиране. Само добре оптимизирани тестови системи могат да избегнат това.

1.5.5 Пробоподготовка на биологичен материал

Използват се различни техники за извличане на ДНК в зависимост от задачите. Тяхната същност се състои в екстракция (извличане) на ДНК от биологичен продукт и отстраняване или неутрализиране на чужди примеси за получаване на ДНК препарат с чистота, подходяща за PCR.

Методът за получаване на чист ДНК препарат, описан от Мармур, се счита за стандартен и вече е станал класически. Включва ензимна протеолиза, последвана от депротеинизация и повторно утаяване на ДНК с алкохол. Този метод дава възможност за получаване на чист ДНК препарат. Това обаче е доста трудоемко и включва работа с такива агресивни и остри вещества като фенол и хлороформ.

Един от популярните в момента методи е методът за екстракция на ДНК, предложен от Boom et al. Този метод се основава на използването на силен хаотропен агент, гуанидин тиоцианат (GuSCN), за клетъчен лизис и последваща сорбция на ДНК върху носител (стъклени перли, диатомит, стъклено мляко и др.). След промиване ДНК остава в пробата, адсорбирана върху носителя, от който може лесно да бъде отстранена с помощта на елуиращ буфер. Методът е удобен, технологичен и подходящ за подготовка на проби за амплификация. Възможни са обаче загуби на ДНК поради необратима сорбция върху носителя, както и по време на многобройни измивания. Това е особено важно при работа с малки количества ДНК в пробата. Нещо повече, дори следи от GuSCN могат да инхибират PCR. Следователно, когато се използва този метод, правилният избор на сорбент и внимателното спазване на технологичните нюанси са много важни.

Друга група методи за подготовка на пробите се основава на използването на йонообменници тип Chilex, които, за разлика от стъклото, не сорбират ДНК, а обратното, примеси, които пречат на реакцията. По правило тази технология включва два етапа: кипене на пробата и адсорбция на примеси върху йонообменник. Методът е изключително атрактивен поради своята простота на изпълнение. В повечето случаи е подходящ за работа с клиничен материал. За съжаление, понякога има проби с примеси, които не могат да бъдат отстранени с помощта на йонообменници. Освен това някои микроорганизми не могат да бъдат унищожени чрез обикновено кипене. В тези случаи е необходимо въвеждането на допълнителни етапи на обработка на пробите.

Следователно изборът на метод за подготовка на пробата трябва да се третира с разбиране на целите на предвидените анализи.

1.5.6 Усилване

За да се извърши реакцията на амплификация, е необходимо да се подготви реакционната смес и да се добави анализираната ДНК проба към нея. В този случай е важно да се вземат предвид някои характеристики на отгряването на праймера. Факт е, че като правило в анализираната биологична проба има различни ДНК молекули, към които праймерите, използвани в реакцията, имат частична, а в някои случаи значителна хомоложност. В допълнение, праймерите могат да се отгряват един към друг, за да образуват праймери-димери. И двете водят до значителна консумация на праймери за синтеза на странични (неспецифични) реакционни продукти и в резултат значително намаляват чувствителността на системата. Това прави трудно или невъзможно разчитането на резултатите от реакцията по време на електрофореза.

1.6 Състав на стандартната PCR реакционна смес

x PCR буфер (100 mM разтвор на Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM разтвор на KCl, 25 mM разтвор на MgCl2 ) …….2,5 µl

Вода (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Смес от нуклеотидни трифосфати (dNTP)

mM разтвор на всеки………………………………………….……….0,5 µl

Праймер 1 (10 mM разтвор) ………………………………………….1 µl

Праймер 2 (10 mM разтвор) ……………………………………….….1 µl

ДНК полимераза (5 единици / µl) ………………………………………………0,2 µl

ДНК проба (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Оценка на резултатите от реакцията

За да се оценят правилно резултатите от PCR, е важно да се разбере, че този метод не е количествен. Теоретично продуктите на амплификация на единични целеви ДНК молекули могат да бъдат открити чрез електрофореза след 30-35 цикъла. На практика обаче това се прави само в случаите, когато реакцията протича при условия, близки до идеалните, което не се среща често в живота. Степента на чистота на ДНК препарата има особено голямо влияние върху ефективността на амплификацията; наличието на определени инхибитори в реакционната смес, от които в някои случаи може да бъде изключително трудно да се отървете. Понякога, поради тяхното присъствие, не е възможно да се амплифицират дори десетки хиляди целеви ДНК молекули. По този начин често няма пряка връзка между първоначалното количество целева ДНК и крайното количество продукти на амплификация.

Глава 2: Приложения на полимеразната верижна реакция

PCR се използва в много области за анализ и в научни експерименти.

Криминалистика

PCR се използва за сравняване на така наречените "генетични пръстови отпечатъци". Нуждаем се от проба от генетичен материал от местопрестъплението - кръв, слюнка, сперма, коса и т.н. Сравнява се с генетичния материал на заподозрения. Достатъчно е много малко количество ДНК, теоретично - едно копие. ДНК се нарязва на фрагменти, след което се амплифицира чрез PCR. Фрагментите се разделят чрез ДНК електрофореза. Получената картина на местоположението на ДНК лентите се нарича генетичен пръстов отпечатък.

Установяване на бащинство

Резултати от електрофореза на ДНК фрагменти, амплифицирани чрез PCR. баща. дете. Майка. Детето наследи някои характеристики на генетичния отпечатък на двамата родители, което даде нов, уникален отпечатък.

Въпреки че "генетичните отпечатъци" са уникални, семейни връзкивсе още може да се инсталира, като се направят няколко такива отпечатъка. Същият метод може да се приложи, с леки модификации, за установяване на еволюционни връзки между организмите.

Медицинска диагностика

PCR позволява значително да се ускори и улесни диагностицирането на наследствени и вирусни заболявания. Генът, който представлява интерес, се амплифицира чрез PCR, като се използват подходящи праймери и след това се секвенира, за да се определят мутациите. Вирусните инфекции могат да бъдат открити веднага след заразяването, седмици или месеци преди появата на симптомите на заболяването.

Персонализирана медицина

Понякога лекарствата са токсични или алергични за някои пациенти. Причините за това са отчасти в индивидуалните различия в чувствителността и метаболизма на лекарствата и техните производни. Тези различия се определят на генетично ниво. Например при един пациент определен цитохром може да е по-активен, при друг - по-малко. За да се определи какъв тип цитохром има даден пациент, се предлага да се проведе PCR анализ преди употребата на лекарството. Този анализ се нарича предварително генотипиране.

Генно клониране

Генното клониране е процес на изолиране на гени и в резултат на генно инженерни манипулации получаване на голямо количество от продукта на даден ген. PCR се използва за амплифициране на ген, който след това се вмъква във вектор, част от ДНК, която пренася чуждия ген в същия организъм или друг организъм, който е лесен за отглеждане. Като вектори се използват например плазмиди или вирусна ДНК. Вмъкването на гени в чужд организъм обикновено се използва за получаване на продукт от този ген – РНК или най-често протеин. По този начин много протеини се получават в индустриални количества за използване в селско стопанство, медицина и др.

ДНК секвениране

В метода за секвениране с използване на белязани с флуоресцентен етикет или радиоактивен изотоп дидезоксинуклеотиди, PCR е неразделна част, тъй като по време на полимеризацията производните на нуклеотидите, белязани с флуоресцентен или радиоактивен етикет, се вмъкват в ДНК веригата. Това спира реакцията, позволявайки да се определят позициите на специфични нуклеотиди след разделяне на синтезираните нишки в гела.

Мутагенеза

В момента PCR се превърна в основен метод за мутагенеза. Използването на PCR позволи да се опрости и ускори процедурата на мутагенеза, както и да я направи по-надеждна и възпроизводима.

PCR методът направи възможно анализирането на наличието на последователности на човешки папиломен вирус в биопсични срезове на човешки цервикални неоплазми, вградени в парафин 40 години преди това изследване. Освен това с помощта на PCR беше възможно да се увеличат и клонират фрагменти от митохондриална ДНК от вкаменелости на човешкия мозък на възраст 7 хиляди години!

Способността за едновременно анализиране на два локуса, разположени на различни нехомоложни хромозоми, беше демонстрирана върху лизати на отделни човешки сперматозоиди. Този подход предоставя уникална възможност за фин генетичен анализ и изследване на хромозомна рекомбинация, ДНК полиморфизъм и др. Методът за анализ на отделни сперматозоиди веднага намери практическо приложение в съдебната медицина, тъй като HLA типизирането на хаплоидни клетки позволява да се определи бащинството или да се идентифицира престъпник (HLA комплексът е набор от гени на човешкия основен комплекс за хистосъвместимост; локусите на HLA комплекса са най-полиморфните от всички известни при висшите гръбначни: в рамките на един вид, във всеки локус, има необичайно голям брой различни алели – алтернативни форми на един и същи ген).

С помощта на PCR е възможно да се идентифицира правилността на интегрирането на чужди генетични структури в предварително определена област на генома на изследваните клетки. Общата клетъчна ДНК се загрява с два олигонуклеотидни праймера, единият от които е комплементарен на мястото на ДНК на гостоприемника близо до точката на вмъкване, а другият на последователността на интегрирания фрагмент в антипаралелната ДНК верига. Полимеразната верижна реакция в случай на непроменена структура на хромозомна ДНК на предложеното място за вмъкване води до образуването на едноверижни ДНК фрагменти с неопределен размер, а в случай на планирано вмъкване, двойно-верижни ДНК фрагменти от известен размер, определен от разстоянието между местата на отгряване на два праймера. Освен това степента на амплификация на анализирания регион на генома в първия случай ще зависи линейно от броя на циклите, а във втория - експоненциално. Експоненциалното натрупване на амплифициран фрагмент с предварително определен размер по време на PCR дава възможност да се наблюдава визуално след електрофоретично фракциониране на ДНК препарат и да се направи недвусмислено заключение за вмъкването на чужда последователност в дадена област на хромозомна ДНК.

Заключение

PCR методът в момента е най-широко използваният метод за диагностициране на различни инфекциозни заболявания. PCR ви позволява да идентифицирате етиологията на инфекцията, дори ако пробата, взета за анализ, съдържа само няколко ДНК молекули на патогена. PCR се използва широко в ранна диагностикаХИВ инфекции вирусен хепатити т.н. Към днешна дата почти няма инфекциозен агент, който да не може да бъде открит чрез PCR.

Списък на използваната литература

1.Падутов В.Е., Баранов О.Ю., Воропаев Е.В. Методи за молекулярно-генетичен анализ. - Минск: Unipol, 2007. - 176 с.

2.PCR "в реално време" / Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и т.н.; изд. b. н. Д.В. Ребриков; предговор Ел Ей Остерман и акад. RAS и RAAS E.D. Свердлов; 2-ро издание, рев. и допълнителни - М.: БИНОМ. Лаборатория Знание, 2009. - 223 с.

.Патрушев Л.И. Изкуствени генетични системи. - М.: Наука, 2005. - В 2 тона

.Б. Глик, Дж. Пастернак Молекулярна биотехнология. Принципи и приложение 589 стр. 2002г

5.Щелкунов С.Н. генното инженерство. - Новосибирск: Сиб. унив. издателство, 2004. - 496 с.

Редактирано от A.A. Ворбьева „Полимеразна верижна реакция и нейното приложение за диагностика в дерматовенерологията”; Агенция за медицински новини - 72 страници

Http://ru. wikipedia.org

http://учен. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. су/ - медицински журнал

Обучение

Нуждаете се от помощ при изучаването на дадена тема?

Нашите експерти ще съветват или предоставят услуги за обучение по теми, които ви интересуват.
Подайте заявлениепосочване на темата точно сега, за да разберете за възможността за получаване на консултация.

PCR диагностика(полимеразна верижна реакция) се използва за откриване на активния стадий на заболяването в комбинация с вече традиционни изследвания, когато няма реакция чрез имунологични и микробиологични диагностични методи.

За известен период PCR диагностиката се използва само за научни цели и едва от края на 20-ти век и началото на 21-ви този анализ се превърна в своеобразен „златен стандарт“, който е от голяма полза в различни области на медицината.

Каква е същността на PCR диагностиката?

PCR диагностиката, за разлика от тази, способна да открива следи от антитела (АТ), установява не само първопричините за патологичното състояние, но и открива наличието на ДНК или РНК на специфично специфично място с помощта на ензими в лабораторията.

PCR анализът е с висока точност, елиминира възможността за фалшиви реакции и не е необходимо да се взема кръв от вена за изследване, достатъчен е малък брой тъканни проби, биологична течност.

Към горния вариант на биологичната среда на материала за изследване, съдържащ предполагаемия инфекциозен агент, няколко опции могат да бъдат присвоени наведнъж по решение на лекаря, включително това може да бъде:

• намазка(секреция от гениталиите);
• изстъргване от лигавицата(уста, нос, гениталии);
• слюнка, храчки или плеврална течност;
• сок от простатата, изследване на секрета на простатата за наличие на вредител;
• плацентарна тъканили амниотична течност;
• общ анализ на уринатаза изследване на утайката (след центрофугиране), ако е необходимо, за откриване на Mycobacterium tuberculosis;
• гръбначно-мозъчна течностза откриване на инфекциозни лезии на централната нервна система;
• събиране на клетки или тъкани(биопсия) от черен дроб, дванадесетопръстник, стомах и др.

Тези проби се поставят в специален реактор и се анализират чрез многократно удвояване (амплификация) на изследваните ДНК фрагменти, чрез многократни цикли на репликация и денатурация с добавяне на специфични ензими за синтез. Според вида на верижната реакция този метод идентифицира вида и индивидуалните характеристики на ДНК или РНК. В крайна сметка процесът на PCR сравнителен анализклонираният генетичен материал ви позволява да идентифицирате дори единични клетки на жив вирус, лесно разграничавайки уреаплазма от микоплазма или.

Предимства и недостатъци на PCR диагностиката

Тази PCR диагностика има както предимства, така и няколко недостатъка.

Предимства на диагностиката:

• дефиницията на патогена дава пряка индикация за наличието в генетичния материал на атипичен участък от ДНК или РНК;
• PCR диагностиката дава 100% точност поради наличието в тестовия материал на частици нуклеинова киселина (фрагменти ДНК или РНК), характерни само за конкретен вирус или бактерия;
• висока чувствителност на PCR системата в сравнение с други диагностични методи. PCR анализът за определяне на наличието на патоген е достатъчен за една клетка от жив вирус (10-100 клетки в проба), което прави възможно откриването на патогенен микроорганизъм в ранен стадий на заболяването при липса на тежки симптоми , и в напреднали форми;
• високотехнологичната автоматизирана PCR амплификация увеличава скоростта на анализа чрез тестване в деня на вземане на пробата (отделяне на не повече от 4-6 часа за диагностика). Това повишава производителността и дава превъзходство над културните методи на изследване;
• многофункционалността на анализа дава възможност, използвайки генетичния материал на ДНК или РНК, взет по различни начини, да се открият няколко патогена от една биологична проба.

Говорейки за недостатъци, тогава, предвид чувствителността на PCR системата, един от неприятните моменти е:

• променливост на микроорганизмите. Недостатъкът е, че мутацията е присъща на микроорганизмите, което води до промяна в изследвания генотип на патогена. И PCR тестовата система в амплифицираната област на генома не може да улови хибрида на вече развиващ се патоген, точно както човешката имунна система не го разпознава, така че няма да има реакция за определяне на наличието на инфекциозно заболяване. Но за това са в ход различни разработки за подобряване на метода PCR;
• възможността за получаване на фалшиво положителен или фалшиво отрицателен резултат. За да не се натъкнете на фалшиви резултати на един от етапите на PCR диагностиката, тя трябва да се извърши внимателно, без да се нарушава процеса, като се спазват правилата за вземане на материала. Пробите могат да променят структурата си или дори да се разпаднат, което може да доведе до фалшиво отрицателен или фалшиво положителен резултат. Трябва да се разбере, че такъв резултат може да възникне, когато инфекцията вече е убита, но мъртвите клетки не са имали време да се обновят и са взети предвид по време на клонирането. Следователно, на ранни датислед лечението се използват други методи (например), и след пълното елиминиране на неактивните патогени от тялото се извършва анализ-контрол чрез PCR. И вече лекуващият лекар взема окончателното решение за целесъобразността на терапията, като взема предвид всички аргументи "за" и "против".

Подготовка за PCR диагностика и условия за изследване

Струва си да се обърне внимание на простата подготовка за PCR, за това е необходимо стриктно да се спазват всички препоръки на лекуващия лекар и да се спазват поне няколко неоспорими условия за по-точен резултат.

В зависимост от метода на вземане на проби от материал за изследване, трябва да се помни, че:

• за диагностика с венозна кръвпациентът трябва да бъде тестван на празен стомах, като се изключва дори употребата на течност;
• да даде намазкае необходимо да се въздържате от сексуален контакт поне няколко дни, разрешено е да извършвате хигиена на гениталиите вечер, но не и в деня на теста. Струва си да изберете оптималното време за изследването, като вземете предвид: два дни преди или след менструалния цикъл;
• за всеки метод на вземане на пробитрябва да спрете няколко седмици преди раждането на употребата на антибактериални средства лекарства, като предварително сте се консултирали с Вашия лекар, тъй като това може да повлияе на надеждността на резултата;
• за изследване на уринатаза да се определи наличието на патогени, е необходимо не само да се спазва стерилността и хигиената, но и качеството на събрания материал за изследване, който носи по-точна информация. Поради това е приемливо да се изчакат 2-3 часа от последното уриниране до събирането на урина или да се използва сутрешна проба, която дава по-голяма вероятност да покаже наличието на възпалителен процес.

Използване на PCR и открити заболявания

За да търсите причинителите на много заболявания, горните препоръки не трябва да се пренебрегват, а предписаният преглед от лекар с помощта на диагностичния метод PCR може да предпази не само възрастен, но и малко, неродено дете в утробата от сериозни усложнения .

Всъщност женската половина от населението най-често страда от някои видове вируси (HPV), което значително увеличава възможността от рак на шийката на матката или безплодие. И с оглед на възможността отрицателно въздействиевърху хода на бременността и развитието на плода, трябва да се има предвид, че различни групи микроорганизми, предавани по полов път или с имунна недостатъчност, е трудно да се отнесат към една или друга група на патогена, тъй като те са много взаимосвързани (напр. , TORCH инфекции и ППИ). Но полимеразната верижна реакция е в състояние да намери чужда структура чрез определяне на специфичния тип вирусна ДНК в женското тяло.

Дешифрирането на резултатите от анализа ви позволява да потвърдите или опровергаете наличието на заболявания. Покривайки широк спектър от патогени, такъв анализ е много важен за навременното откриване на много инфекции, като:

• откриване на HIV инфекция. Тежко увреждане на имунитета от инфекция, която засяга основно имунокомпетентните клетки, присъстващи на повърхността на имунната система върху CD4 рецепторите, които впоследствие губят способността си да се защитават срещу инфекции и спират да реагират на наличието на вирусна РНК в кръвната плазма. В случай на положителен резултат по време на анонимен преглед, той се повтаря с добавяне на допълнителни изследвания;
• вирусен хепатит, най-често хепатит С(съдържащ РНК патоген), който поради лесната си поносимост е трудно да се диагностицира с други методи, тъй като PCR методът е по-оптимален за разпознаване на патогена в кръвта или чернодробна биопсия. се проявява в късен стадий, образувайки злокачествен възпалителен процес. Въпреки това си струва да се има предвид, че ако резултатът е положителен по време на теста за наличие на антитела в кръвта (AT), а PCR тестът дава отрицателен резултат, това може да показва наличието на вирус в тялото в много малко количество, или засегнатите клетки са в стадий на висящ процес в генома на чернодробните клетки без достъп до кръвния поток. В такива случаи ще бъдат извършени редица повторни изследвания за окончателна диагноза и методи на лечение;
• онкогенни вируси като HPV(човешки папиломен вирус) с повече от 100 различни видовевирус, който се предава по полов път или по време на медицински процедури, инфекция на новородено от майката преминава през родовия канал, ако тя е носител на инфекция с човешки папиломен вирус;
• STI(полово предавани инфекции);
• подходящ за откриване на всички ППБ(, гарднерелоза,) и TORCH инфекции;
• показва с висока степен на точност с инфекция с мононуклеоза, характеризиращи се с увреждане на лимфната и ретикулоендотелната система (увеличени лимфни възли, далак, черен дроб), могат да бъдат открити с помощта на PCR диагностика, като се вземе кръвен серум като материал за изследване. Болестта на Филатов, според външни параметри, може да се прояви като обриви, жлъчка кожата, бял налеп по езика.
• , проникващи в кръвта на пациенти със СПИН и реципиенти на трансплантирани органи с употребата на лекарства за потискане на имунната система;
• херпетична инфекция, представляващ един или друг вид херпес, който може да засегне гениталиите, лигавицата на очите или кожата;
• туберкулоза. При наличие на основните симптоми на заболяването се предписва PCR анализ след резултатите от бронхоскопията, което ви позволява да диагностицирате активния стадий на туберкулоза много по-бързо, отколкото с помощта на бактериологичен или бактериоскопски метод;
• вирусни инфекциозни заболявания като енцефалит, пренасян от кърлежи(Борелиоза). Характеризира се с увреждане на клетките нервна система, интоксикация, възпаление на мозъка и впоследствие развитие на парализа. За откриване на антигена чрез PCR диагностика се вземат кръв и цереброспинална течност за изолиране на РНК вируса.
• откриване на инфекция с Helicobacter pylori(водещи до хроничен гастрит, пептична язва, тумори на стомаха) чрез PCR диагностика позволява откриване на ДНК (генетичен материал) на Helicobacter pylori в биопсия, изпражнения, слюнка, разграничаване на щамовете според степента на злокачественост.

PCR диагностиката на инфекциите се развива с ускорени темпове и се използва успешно в онкологията, гинекологията, урологията, гастроентерологията, вирусологията, като списъкът се актуализира постоянно, но не се ограничава до търсенето на патогени на инфекциозни заболявания. Сред другите практически приложения на метода PCR може да се открои и използването на изследвания за установяване на бащинство и идентифициране на човек.

PCR диагностиката е техника, основана на използването на полимеразна верижна реакция, която може да се използва за изследване на човек за инфекциозни и наследствени заболявания. PCR анализите за 12 инфекции показват резултат, независимо дали заболяването е остро или хронично.Някои експерти смятат PCR 12 за задължителен анализ и без него не правят окончателна диагноза. Резултатите могат да бъдат положителни дори много преди появата на симптомите на заболяването.

През 20-ти век Кари Мълис от САЩ открива явлението полимеразна верижна реакция. В момента PCR методът е златен стандарт в някои области на медицината. Методът е най-ефективен за откриване на заболяване в активен стадий, тъй като има случаи, когато конвенционалните методи не дават толкова точен резултат в активен стадий.

Диагностиката на инфекциозни процеси с помощта на PCR е доста уместна в модерен свят. Предимствата на този вид изследване са следните:

1. Откриване на инфекциозен агент в анализите. Анализът включва идентифициране на ДНК или РНК на инфекциозен агент.
2. Фалшивите и погрешни реакции са практически изключени.
3. PCR методът 12 е най-чувствителен. Благодарение на този метод могат да бъдат открити дори единични клетки от инфекциозни агенти.
4. Резултатът от PCR за скрити патогени е готов до 4 часа след процедурата.
5. Възможност за откриване на инфекциозни агенти без липса на характерни за заболяването симптоми. Методът е доста ефективен при възникване на конкретно заболяване.

В съвременния свят PCR диагностиката на инфекциите се развива с ускорени темпове. Техниката се усъвършенства активно. Появяват се нови разновидности PCR изследвания. Благодарение на развитието този методпреглед, той става възможно най-достъпен за широк кръг от хора, докато цената постепенно се променя.

Основата на полимеразната верижна реакция

PCR методът се извършва изключително в лаборатория. За провеждането му се използват специални ензими, които увеличават няколко пъти структурата на ДНК и РНК на пациента. Трябва да се образува такова количество ДНК и РНК, за да може да се извърши визуален анализ. По време на изследването се копира копие на РНК или ДНК секция, което идеално отговаря на необходимите условия.

Лабораторията поддържа база данни с точната структура на различните инфекциозни агенти. Благодарение на PCR метода можете не само да видите патогена, но и да изчислите неговото количествено съотношение.

PCR диагностиката включва и някои иновации, сред които могат да се разграничат следните:

• въвеждане на мутации;
• свързване на отделни ДНК фрагменти;
• установяване на бащинство и др.

Инфекции, открити чрез PCR анализ

PCR диагностиката може да разкрие следните инфекциозни процеси:

• хепатит от следните сортове: A, B, C, G;
• Вирус на Epstein-Barr, причинител на инфекциозна мононуклеоза;
• цитомегаловирус;
• Mycobacterium tuberculosis;
• херпес 1 и 2 вида;
• много полово предавани инфекции: уреаплазмоза, гарднерелоза, хламидия, микоплазмоза, трихомониаза.
• HPV и неговите онкогенни подвидове;
• енцефалит, пренасян от кърлежи, и борелиоза;
• инфекция с кандида;
• листериоза;
• Инфекция с Helicobacter pylori.

И това са само някои от най-честите инфекции, които могат да бъдат открити чрез PCR. PCR кръвният тест се използва активно в гинекологичната област на медицинската практика, както и в области като:

• пулмологични;
• фтизиатрични;
• гастроентерологични;
• онкологични;
• много други клонове на медицината.

Правила за събиране на материал за анализ

Чуждата ДНК и РНК могат да бъдат открити чрез изследване на различни телесни течности на конкретен човек. За да се изследва дадено лице за наличие на определени инфекции, предавани по полов път, е необходимо да се вземе проба от изхвърлянето от гениталните органи (намазка или изстъргване) на пациента и неговата урина.

Ако е необходимо да се изследва човек за различни видове инфекции (HIV, херпес, хепатит и други), тогава се взема PCR анализ, за ​​който се използва кръвта на пациента.

За да диагностицирате херпесна лезия, мононуклеоза, трябва да вземете цитонамазка от устната кухина на пациента. За да се потвърди CMVI, урината на пациента се взема за анализ. Има случаи, когато се изследва цереброспиналната течност, за да се установят причините за възникналите неврологични аномалии.

В същото време пулмологът изследва храчките и течността от плеврата на конкретен пациент с помощта на PCR метода.

Ако новородено бебе има подозрение за вътрематочна инфекция, лекарите вземат анализ на амниотична течност от бременна жена и парче плацентарна тъкан.

Доставка на анализ: характеристики на процедурата и интерпретация на резултатите

Всички пациенти, изследвани чрез PCR метода, получават най-надеждния резултат. В този случай възникването на грешки е практически изключено. Резултатите от този анализ се подготвят достатъчно бързо, което улеснява диагнозата и осигурява навременното назначаване на терапевтични мерки.

Надеждността на резултата от PCR зависи пряко от правилността на доставянето на материала за изследване. Материалът не трябва да бъде замърсен, в противен случай резултатът от изследването няма да бъде обективен. Най-важните препоръки преди провеждане на PCR тест включват следните изисквания:

1. Един ден преди анализа е забранено да имате сексуална активност.
2. Кръвният тест за инфекции трябва да се вземе сутрин на празен стомах.
3. Урината се дава сутрин в стерилен съд.

Резултатът от анализа ще бъде готов след 1,5-2 дни след въпросната процедура. Има ситуации, когато резултатът може да бъде подготвен в същия ден.

Дешифриране на резултатите

Резултатът от този вид изследване може да бъде положителен или отрицателен. Отрицателният резултат от кръвен тест показва, че в предоставения материал няма инфекциозни елементи. Голям брой направени PCR тестове показват отрицателен анализ.

Положителният PCR анализ потвърждава факта, че в предоставения материал са открити инфекциозни агенти и е необходимо висококачествено, максимално ефективно лечение на пациента.

Резултатът може да е положителен, но няма прояви на болестта. Това показва или началото на заболяването, или неговото носителство. Ако се открие носител на болестта, тогава не се изискват терапевтични мерки. Просто трябва да посетите специалист. Примери за такива заболявания са:

• папиломавирусна инфекция;
• херпес и др.

Обикновено те се намират в слюнката, изстъргванията от цервикалния канал, уретрата. Трябва обаче да се помни, че болен човек може да зарази абсолютно здрави хора, въпреки факта, че това заболяване не го притеснява по никакъв начин. Болестта може да стане хронична. Трябва да се отбележи, че в случаите, когато PCR кръвният тест показа положителен резултат, назначаването на терапевтични мерки е просто необходимо.

PCR анализът има и количествена характеристика. Количественият резултат се оценява само от специалист, той е индивидуален за различните инфекции. Въз основа на количествените характеристики лекарят може да разбере колко активен е този патологичен процес, да определи точния етап на развитие на дадено заболяване. Анализирайки получените резултати, специалистът може да избере необходимото лекарство и евентуално да преразгледа дозировката на лекарството.

Точност на PCR диагностика

Специалистите получават PCR 3 най-важни характеристики, сред които са:

1. точност.
2. Специфичност.
3. Чувствителност.

Диагностиката на инфекции чрез PCR има голяма вероятност за откриване на инфекциозни агенти. PCR анализът на кръв и други течности е много специфичен. С негова помощ можете лесно да идентифицирате конкретен инфекциозен процес. PCR диагностиката е много чувствителна. Ако тестовият материал съдържа минимално количество инфекциозни агенти, PCR методът винаги ще бъде положителен.

Най-редкият е фалшив положителен резултат. Ако няма инфекция, резултатът е отрицателен.

PCR за латентен инфекциозен процес

Ако се подозира ППИ при човек, тогава се предписва кръвен тест за латентни инфекции. Сексуалните заболявания могат да бъдат открити само чрез изследване на пациента. Заболявания като:

• хламидия;
• уреаплазмоза;
• гонорея;
• херпес;
• гарднерелоза;
• микоплазма.

Горните полови инфекции са доста чести и в същото време коварни. В началния стадий на развитие на заболяването те не дават ярки симптоми и пациентите не търсят помощ. При съмнение за тези инфекции е необходим PCR кръвен тест, изстъргвания от лигавицата на уретрата и цервикалния канал.

ППИ имат много негативно въздействие върху репродуктивна система. Те могат да причинят безплодие или малформации на плода. В тази връзка, преди да планирате бременност, трябва да направите PCR тест.

PCR за 12 инфекции е популярен. Диагнозата чрез PCR 12 се извършва чрез вземане на тампони от гениталиите. Материалът се взема 2 часа след акта на уриниране. 2 дни преди изследването супозиториите не трябва да се поставят във влагалището и не трябва да се извършва промиване. Резултатът от анализа ще бъде готов след 2 дни.

Цената на PCR варира в зависимост от изследваната инфекция.Цената варира от 200 до 500 рубли за всяка инфекция. Можете да влезете и да се изследвате в частна лаборатория самостоятелно, без направление от лекар.

Полимеразната верижна реакция е известна от 30 години. Той се използва широко в много области, от археология до генетика.

Това е PCR методът, който помага да се установи бащинството, но най-често се използва за откриване на различни инфекциозни заболявания в човешкото тяло.

Как се извършва PCR анализът и какво представлява? Ще се опитаме да отговорим подробно на тези въпроси.

PCR анализ - какво е това?

Полимеразната верижна реакция (PCR) е високоточен метод за молекулярно-генетична диагностика, който позволява да се открият различни инфекциозни и наследствени заболявания при хората, както в остър, така и в хроничен стадий, и много преди болестта да се прояви.

PCR методът е абсолютно специфичен и при правилно изпълнение не може да даде фалшиво положителен резултат. Тоест, ако няма инфекция, тогава анализът никога няма да покаже, че е така. Ето защо сега много често, за да се потвърди диагнозата, се взема допълнителен PCR анализ за определяне на патогена и неговия характер.

Полимеразната верижна реакция (PCR) е разработена през 1983 г. от Кари Мълис (САЩ), за което той е награден през 1993 г. Нобелова наградав областта на химията.

Какво е предимството на този метод?

Диагнозата чрез този метод ви позволява да намерите патогена директно в гена, съдържащ се в изследваните материали. Това е най-точният анализ за полови инфекции, латентни инфекции, различни полово предавани болести.

Разлики между PCR диагностиката и други лабораторни методи за изследванеса както следва:

• методът е насочен към идентифициране на самия патоген;
• диагностиката чрез PCR е многостранна: за откриване на няколко патогена;
• заболявания, достатъчна е само една биологична проба от пациента;
• методът е силно чувствителен и не е придружен от други кръстосани реакции.

В допълнение, предимството на PCR диагностиката е, че всеки биологичен материал на пациента е подходящ за анализ: кръв, секрети от гениталните органи, урина, сперма.

Какви инфекции могат да бъдат открити чрез PCR цитонамазка?

Тялото може да има голям бройпричинители на инфекции, това включва „скритите“, които не се проявяват дълго време.

PCR анализ на цитонамазка прави възможно откриването на такива инфекции:

• уреплазмоза на гениталните органи;
• кандидоза ();
• херпес;
• наличието на ракови клетки;
• оценка на хормоналното състояние;

Изследваният материал за PCR обикновено е храчка, слюнка, урина, кръв. Преди да извършите анализа, е необходимо внимателно да се подготвите за него, след като сте получили предварителна консултация с лекар.

Кръвта за PCR обикновено се дарява на празен стомах. Добри резултати се показват при анализ, когато материалът за изследване се взема от цервикалния канал или уретрата. В този случай е най-добре да се извърши PCR диагностика не по-късно от един ден след полов акт.

Разновидности на PCR

PCR се използва в много области за анализ и в научни експерименти. Има различни методи за анализ:

1. PCR с обратна транскрипция(PCR с обратна транскрипция, RT-PCR (английски)) - използва се за амплифициране, изолиране или идентифициране на известна последователност от библиотека на РНК.
2. Обърнат PCR(Inverse PCR (английски)) - използва се, ако е известна само малка област в желаната последователност. Този метод е особено полезен, когато е необходимо да се определят съседни последователности след вмъкване на ДНК в генома.
3. Вложената PCR се използва за намаляване на броя на страничните продукти на реакцията. Използвайте два чифта праймери и извършете две последователни реакции.
4. Асиметричен PCR(англ. Asymmetric PCR) - провежда се, когато е необходимо да се амплифицира основно една от веригите на оригиналната ДНК. Използва се в някои техники за секвениране и хибридизационен анализ.
5. Количествен PCR(Количествена PCR, Q-PCR (на английски)) или PCR в реално време - използва се за директно наблюдение на измерването на количеството на определен PCR продукт във всеки реакционен цикъл.
6. Стъпаловидна PCR (Touchdown PCR (на английски)) - при този подход се намалява влиянието на неспецифичното свързване на праймерите.
7. Групово-специфична PCR(англ. group-specific PCR) - PCR за свързани последователности в една или между тях различни видовеизползвайки консервативни праймери за тези последователности.

Ако нуклеотидната последователност на шаблона е частично известна или изобщо не е известна, могат да се използват изродени праймери, чиято последователност съдържа изродени позиции, в които могат да бъдат разположени всякакви бази. Например последователността на праймера може да бъде: …ATH… където H е A, T или C.

Какви биологични материали се изследват?

Различни биологични среди и човешки течности могат да служат като материал за PCR изследване, в което може да се открие чужда ДНК на бактерия или ДНК или РНК на вирус:

1. Урина. Може да се използва за инфекциозни лезии на пикочно-половата система при мъжете и пикочните органи при жените (при мъжете използването на урина като материал замества остъргването на епитела).
2. храчки. Използва се за диагностика на туберкулоза и по-рядко за диагностика на респираторни форми на хламидия и микоплазмоза. Храчките в количество от 15-20 ml се събират в стерилен (еднократен) флакон.
3. биологични течности. По показания се вземат простатен сок, плеврална, цереброспинална, амниотична течност, ставна течност, бронхоалвеоларен лаваж, слюнка.
4. Епителни изстъргвания от лигавиците. Обикновено се използва за диагностициране на полово предавани болести (ППБ), като гонорея, хламидия, микоплазмоза, уреаплазмоза, трихомониаза, гарднерелоза, херпес и други инфекции, които засягат лигавиците.
5. Биопсии. Най-често се използват биопсични проби от стомаха и дванадесетопръстника за откриване на инфекция с Helicobacter pylori.
6. Кръв, плазма, серум. Използва се за PCR анализ на вируси на хепатит B, C, D, G, херпес, CMV, HIV, човешки гени.

Как да се подготвим за анализа?

Надеждността на резултата от PCR зависи пряко от правилността на доставянето на материала за изследване. Материалът не трябва да бъде замърсен, в противен случай резултатът от изследването няма да бъде обективен. Най-важните препоръки преди провеждане на PCR тест включват следните изисквания:

1. Урината се дава сутрин в стерилен съд.
2. Кръвният тест за инфекции трябва да се вземе сутрин на празен стомах.
3. Не трябва да сте сексуално активни в деня преди теста.

Резултатът от анализа ще бъде готов след 1,5-2 дни след въпросната процедура. Има ситуации, когато резултатът може да бъде подготвен в същия ден.

Дешифриране на анализа на PRP

Процесът на тълкуване на представеното изследване се отличава със своята простота. резултати pcr анализмогат да бъдат получени след 1,5-2 дни след доставката на материала. В някои случаи резултатът е готов на първия ден и това може да означава:

• Отрицателен резултатпоказва, че диагностицираният материал не съдържа желания инфекциозен агент.
• PCR положителенпоказва, че ДНК или РНК на патогена присъства в човешкото тяло.

В някои случаи се извършва количествено определяне на микроорганизми. Това е особено вярно при заболявания, причинени от опортюнистични патогени. Тъй като тези бактерии показват своите отрицателни ефекти само когато са в излишък.

Също така, количественият PCR анализ е важен за избора на терапевтична тактика и за целите на мониторинга на лечението на вирусни инфекции като ХИВ и вируси на хепатит.

Колко точен е PCR при диагностицирането на инфекции?

PCR методът се характеризира с висока точност, специфичност и чувствителност. Това означава, че този анализ може да:

• точно определяне на наличието или отсъствието на инфекция;
• посочете точно за какъв вид инфекция става въпрос (специфичност);
• откриване на инфекция дори при много ниско съдържание на микробна ДНК в биологичен материал,
• който е тестван (чувствителност).

PCR анализ: цена и условия

Цената на конкретен анализ ще зависи от това за коя инфекция ще бъдете тествани. Ориентировъчни цени и срокове:

1. STI: 300-500 рубли, срокове - 1 ден;
2. Вирус на Epstein-Barr, човешки папиломен вирус, херпес, цитомегаловирус: 300-500 рубли, срокове - 1 ден;
3. Хепатит A, B, C, D, G: качествен анализ 650 рубли, количествен анализ 2000 рубли. Срокове – до 5 дни;
4. Антитела срещу вируса на хепатит С, общо (Anti-HCV) - 420 рубли;
5. Антитела срещу вируса на хепатит С, IgM (Anti-HCV IgM) - 420 рубли;
6. Helicobacter pylori (Helicobacter pylori): 300-400 рубли, срокове - 1 ден;
7. HIV (антитела и антигени) - 380 рубли;
8. ХИВ РНК, качествено - 3500 рубли;
9. ХИВ РНК, количествено - 11 000 рубли.

За да спестите пари, можете да изберете фиксиран пакет от анализи. Тази услуга се предоставя от повечето клиники, където можете да направите анализ по метода PRC (ин витро, онклинични и др.).