PCR muayenesi. PCR kan testi kullanılarak neler belirlenebilir ve nasıl bağış yapılır?

Bulaşıcı hastalıkların tanısında PCR smear aşağıdaki avantajlara sahiptir:

• Bulaşıcı hastalıkların patojenlerinin doğrudan tespiti.

Birçok geleneksel yöntemler laboratuvar teşhisi, patojenlerin çeşitli dolaylı işaretlerle tanımlanmasını içerir. Örneğin, ELISA teşhisi, hastanın kanındaki, bulaşıcı patojenlerin bozunma ürünleri olan ve doktorun belirli bir teşhis yapabileceği proteinlerin tespitine dayanır. PCR analiz yöntemi, hastadan alınan materyalde, hastalığa neden olan ajanın DNA'sının belirli bir bölgesinin varlığının doğrudan bir göstergesini verir.

• PCR teşhisinin yüksek özgüllüğü.

Analiz sırasında, test materyalinde belirli bir DNA parçası izole edilir, yani yalnızca belirli bir patojende - yalnızca belirli bir bakteri veya virüste bulunur. DNA'nın bu bölümü benzersizdir ve dünyadaki herhangi bir enfeksiyonun özelliği değildir.

• Yüksek hassasiyetli PCR.

Hastadan alınan materyal sadece bir bakteri veya virüs hücresi içeriyor olsa bile enfeksiyonun tespiti mümkündür. Diğer immünolojik ve mikrobiyolojik tanı yöntemleriyle karşılaştırıldığında: PCR analizinin duyarlılığı numune başına 10-100 hücre, diğer yöntemler - 103-105 hücredir.

0Array ( => Analizler) Dizi ( => 2) Dizi ( =>.html) 2

• PCR analizinin çok yönlülüğü.

PCR araştırması için, diğer yöntemlerle araştırma için uygun olmayanlar da dahil olmak üzere hemen hemen her malzeme kullanılabilir: mukus, idrar, kan, serum, balgam, ejakülat, epitel hücrelerinin kazınması - enfeksiyon herhangi bir biyolojik salgıda bulunabileceğinden ve dokular.

• PCR analizinin sonucunu elde etmede yüksek hız.

Bir hastadan analiz için alınan materyali işlemek için tek bir yöntem, reaksiyon ürünlerinin tespiti, otomatik PCR amplifikasyonu 4-5 saat içinde eksiksiz bir PCR teşhisinin yapılmasını mümkün kılar. Aynı zamanda, kültürel araştırma yöntemlerine çok daha fazla zaman harcanır - birkaç günden birkaç haftaya kadar, çünkü hücre kültüründe patojeni izole etmek ve sonra büyütmek gerekir.

• Herhangi bir enfeksiyon türünü teşhis etme yeteneği.

Yüksek hassasiyet PCR yöntemi bir enfeksiyonu teşhis etmeyi mümkün kılar sadece akut evre hastalıklar, aynı zamanda kronik enfeksiyonlar ve hatta tek bakteri veya virüslerin varlığı.

PCR ile bir yayma, flora yaymasında tespit edilemeyen enfeksiyonları tanımlamanıza izin verir: klamidya, üreaplazmoz, mikoplazmoz, genital herpes.

Araştırma yöntemi ne kadar önemli olursa olsun, PCR teşhisinin de bazı sınırlamaları vardır. PCR teşhisinin dezavantajları şunları içerir:

• Yanlış pozitif sonuç alma olasılığı

PCR analizi gösterebilir olumlu sonuç enfeksiyon zaten ölmüş olsa bile, antibiyotikler tarafından "öldürülür", ancak ölü hücreleri hala hastanın dokularında bulunur. Bu nasıl mümkün olabilir? Çok basit. Örneğin, enfeksiyon epitel hücrelerinde (genital organların veya gözlerin mukoza zarında) yaşar. Ve o iyileşti. Ancak epitel hücrelerini “yenilemek” zaman alır. Materyal tam hücre yenilenmesi döneminden önce bir doktor tarafından alınırsa materyal, enfeksiyonun ölü hücrelerini içerebilir. Hücreler açıkça genetik materyal içerir - PCR "arayan" patojenin DNA'sı veya RNA'sı. PCR, ölü hücreleri canlılardan ayırt etmez: DNA'yı arar ve onları büyük miktarlarda "klonlar". Bu analizin sonucu olumludur. Aslında, bu yanlış bir pozitiftir.

PCR'nin ölü bir enfeksiyonu canlı olandan "ayırt edememesi", PCR kullanırken ve tedavinin etkinliğini izlemek için belirli gereklilikler getirir. Ana kural, elbette, ortalama bir insanda 4-8 hafta içinde ortaya çıkan, enfeksiyonun ölü kalıntılarının vücuttan tamamen atılmasını beklemektir. Bu süreden sonra, son antibiyotik tableti alındıktan sonra, tedavinin etkinliğini izlemek için PCR yöntemi kullanılabilir ve kullanılmalıdır.

gastroenteroloji teşhis kompleksi - 5 360 ruble

SADECE MARTEsave'de - %15

1000 ruble Yorumlu EKG kaydı

- 25%öncelik
Doktor ziyareti
hafta sonu terapisti

980 ovmak. ilk hirudoterapist randevusu

terapist randevusu - 1.130 ruble (1.500 ruble yerine) "Sadece Mart ayında, cumartesi ve pazar günleri, %25 indirimli bir pratisyen hekim ile randevu - 1.500 ruble yerine 1.130 ruble (fiyat listesine göre teşhis prosedürleri ödenir)

Daha fazlası için erken tarihler Tedavinin kontrolü yalnızca kültürel yöntem veya ekim kullanılarak yapılabilir: yalnızca canlı çoğalan mikroorganizmalar tedavi edilemezliğin bir işareti olarak hizmet edebilir.

• Gardnerelloz teşhisi için PCR analizinin kullanılması istenmez, çünkü bu hastalığın etken maddeleri olan gardnerella normalde vajinada az miktarda yaşar. PCR kullanıldığında bu bakterilerin DNA'sı tekrar tekrar bulunacaktır. Gardnerella yaymada olmamalıdır ve bu durumda bakteriyoskopi, gardnerelloz teşhisi ve tedavinin izlenmesi için yeterli bir yöntemdir.
• Mikroorganizmaların değişkenliği

Herhangi bir mikrop, DNA düzeyinde değişme yeteneğine sahiptir. Bu alandaki en çarpıcı örnek influenza virüsüdür. Bir kez hasta olan bir kişi virüse karşı antikorlar geliştirir. Tamamen teorik olarak, en az bir kez grip olmuşsak, su çiçeği gibi ikinci kez hastalanmamalıyız. Ama neredeyse her yıl hasta oluyoruz. Sebebi ne? Virüs "mutasyona uğrar", genomunu hafifçe "değiştirir" ve bağışıklık sistemimiz, antikorlarımız artık eski konuğu yeni bir kılıkta "tanımaz". Ne yazık ki yine grip olmak zorundasın...

Bir amplifikatör tasarlarken (test PCR sistemi), değişikliklere en az duyarlı olan belirli bir mikroorganizmaya özgü bir DNA parçası kullanılır. DNA'nın sözde yüksek oranda korunmuş bölgesinden "seçilir". Ancak mikroorganizmaların değişkenliği, incelenen patojenin bazı genotiplerinin veya suşlarının, genomun amplifiye (klonlanmış) bölgesinde mutasyonlar kazanabilmesine ve dolayısıyla bu test sistemi tarafından anlaşılması zor hale gelmesine yol açabilir.

Dolayısıyla farklı test sistemleri, farklı laboratuvarlarda ve farklı kliniklerde “aynı” PCR yöntemiyle yapılan analizlerin taban tabana zıt sonuçlar vermesinin nedenlerinden biridir. Mutasyon hatalarından mümkün olduğunca kaçınmak için, bir test sisteminin kendisinden önce geçmesi gereken testlerin kapsamını (çapraz reaksiyonların test edilmesi ve ayrıca saptanabilir bir patojenin bilinen suşlarının test edilmesi dahil) yöneten standartlar geliştirilmiştir. piyasaya girer ve sağlığınızın teşhisi için kullanılır. Bu nedenle iyi klinikler ve laboratuvarlar en yeni nesil test kitlerini kullanır. Ve tıp merkezimiz "Euromedprestige", müşterilerine yüksek kaliteli teşhisler sunabilen az sayıdaki merkezden biridir.

Modern tıpta vücut sıvılarının PCR analizi son derece doğru ve bilgilendiricidir. Bu analiz sayesinde hastalıklar gizlenmiş ve herhangi bir belirti vermese bile vücutta viral ve mikrobiyal partiküllerin varlığı tespit edilir.

PCR analizi randevusu sizin için ne ifade ediyor? Bu kısaltma, polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi anlamına gelir. özel yol laboratuvar araştırması yapmak. Bu yöntemle hastadan alınan biyolojik materyal özel bir aparata yerleştirilir. Patojenin (virüs veya mikrop) genetik materyalinin yeniden üretilmesine yardımcı olan, incelenen ortama bir dizi reaktif enzim eklenir. Reaksiyon tekrarlandığında çok sayıda Veri tabanı ile karşılaştırma yaparak hem viral hem de mikrobiyal enfeksiyonları tanımlamayı mümkün kılan DNA veya RNA kopyaları.

PCR analizinin sonucu ne anlama geliyor? İnsan vücudunda herhangi bir enfeksiyona neden olan bir ajan varsa, gizli bile olsa, bu analiz sadece varlığını değil, aynı zamanda bu enfeksiyonun vücutta ne kadar bulunduğunu da ortaya çıkaracaktır.

PCR ile enfeksiyonları analiz etmek için vücudun tüm biyolojik sıvılarını - kan, idrar, tükürük, genital salgılar, boğaz ve burun mukusu - inceleyebilirsiniz. Analiz için çok az malzeme gereklidir, çünkü patojenler varsa, kopyalarının çoğaltılması nedeniyle konsantrasyon genetik bilgi mikrop veya virüsü ortaya çıkaracak ve türünü belirleyecek şekilde getirilir. PCR analizinin doğruluğu çok yüksektir, günümüzde bu analiz yardımıyla hemen hemen tüm yaygın viral, mikrobiyal ve diğer enfeksiyonlar belirlenebilmektedir.

Ancak, PCR analizi en sık neyi ortaya çıkarır? Bu yöntemle tespit edilebilen enfeksiyonların listesi, tüberküloz veya hepatit B ve C gibi sosyal açıdan tehlikeli enfeksiyonlar dahil bulaşıcı enfeksiyonları içerir. Aynı yöntem HIV enfeksiyonunu, klamidyal ve üreaplazma enfeksiyonlarını, hem solunum sistemi hem de genital mikoplazmozis tespit edebilir. Bu analiz yardımıyla pamukçuk, bakteriyel vajinoz, trichomoniasis tespit edilir. yetenekler Bu method gizli enfeksiyonları tanımlamanıza izin verir - çeşitli tiplerde uçuklar, HPV (papilloma virüsü) ve ayrıca mide ülserlerinin gelişiminden sorumlu özel bir mikropun tanımlanması - helikobather.

Bugün, hemen hemen tüm özel veya kamu laboratuvarlarında PCR testi yapabilirsiniz. Bu tür testler herkes, çocuklar ve yetişkinler için yapılır. Analizin amacına bağlı olarak, cinsiyete bağlı olarak farklı biyolojik materyalin analizi yapılır.

Bu nedenle, erkeklerde PCR analizi, kan veya idrar, üretral sekresyon, farenks veya burundan mukus, prostat suyu ve hatta sperm ile gerçekleştirilir. Kadınlarda PCR analizi kan ve idrarda, vajinal salgılarda, üretradan salgılarda, nazal mukus ve farinkste mümkündür.

Çok sık, PCR analizi hamilelik sırasında kullanılır, yardımı ile vajinal salgı veya kanda gizli enfeksiyonlar tespit edilir, bu süre zarfında özel izleme ve bazen yeterli tedavi gerekir.

PCR analizi nasıl alınır

Bu yöntemle enfeksiyon analizi bir doktor tarafından reçete edilir, genellikle malzeme toplama hemen bir doktorun ofisinde - bir ürolog veya jinekolog - gerçekleştirilir. PCR analizi nasıl yapılır?

Test materyali laboratuvarda reaktiflerle karıştırılır ve reaksiyonu bekler. Patojenlerin varlığında DNA veya RNA kopyaları çoğalır. Cihaz, tanımlanmış genetik materyal parçalarını veritabanlarıyla karşılaştırır ve enfeksiyonun nedensel ajanını doğru bir şekilde tanımlar. Gerekirse, belirli vücut sıvılarındaki patojen miktarı da belirtilir. Genellikle çalışma 1-2 günden fazla sürmez, gerekirse ekspres testler yapılır.

PCR analizi nereden alınır? Bu, ne tür patojenlerin beklendiğine bağlı olacaktır. HIV veya hepatit ise kan, cinsel enfeksiyon ise üretra veya vajinadan sürüntü alınır. Mononükleoz veya uçuk şüphesi varsa boğazdan sürüntü alınır. İdrar, beyin omurilik sıvısı, yaralardan akıntı, balgam vb. de kullanılabilir.

PCR kan testi

Doğru sonuçlar ve enfeksiyonların teşhisi için sabahları aç karnına kan bağışı yapmak önemlidir. PCR kan testi patojenleri tanımlayabilir Tehlikeli hastalıklar- HIV, hepatit, frengi. Virüsün kandaki alevlenme ve aktivite dönemlerinde, herpes virüsleri, papilloma virüsleri ve diğerleri tespit edilebilir.

PCR analizi: hazırlık

Analizin mutlak doğruluğu için buna uygun hazırlık önemlidir. Kan testine hazırlanmanın en kolay yolu, diyet veya aktivite kısıtlaması yoktur, sabahları aç karnına kan bağışı yapmanız gerekir. Cinsel organlar yıkandıktan sonra orta kısımdan özel steril bir kaba idrar testi yapılır. Genital sistemden yapılan PCR analizi özel ilgiyi hak eder, bu nedenle nasıl hazırlanacağını bilmek önemlidir. Muayeneden bir gün önce cinsel ilişki yasaktır, muayeneden önce idrar yapılmaması tavsiye edilir. Kadınlarda adet görürken, analiz tarihi son taburculuk anından itibaren 3-5 gün ertelenir.

PCR analizi ne kadar sürer

Laboratuvarın yeteneklerine bağlı olarak analiz, birkaç saatten birkaç güne kadar hazırlanabilir. PCR analizi ortalama kaç günde yapılır? Genellikle bir veya iki gündür. Acil bir durumda, analiz birkaç saat sonra aynı gün içinde yapılabilir.

Son zamanlarda güvenilir, son derece hassas ve hızlı yöntemçeşitli insan bulaşıcı hastalıklarının teşhisi. Bu yönteme "PCR analizi" denir. Nedir, özü nedir, hangi mikroorganizmaları ortaya çıkarabilir ve nasıl doğru bir şekilde alınacağını yazımızda anlatacağız.

keşif geçmişi

Ayrıca kanser tanısında PCR yöntemleri kullanılmaktadır.

Yöntemin avantajları

PCR teşhisinin birkaç avantajı vardır:

1. Yüksek hassasiyet. Sadece birkaç mikroorganizma DNA molekülünün varlığında bile, PCR analizi enfeksiyonun varlığını belirler. Yöntem, kronik ve geç ortaya çıkan hastalıklara yardımcı olacaktır. Çoğu zaman bu gibi durumlarda, mikroorganizma başka türlü kültürlenmez.
2. Herhangi bir materyal araştırma için uygundur, örneğin tükürük, kan, genital salgılar, saç, epitel hücreleri. En yaygın olanı PCR için kan testi ve ürogenital yaymadır.

   

3. Bitkilerin uzun süreli ekimi gerekli değildir. Otomatik teşhis süreci, çalışmanın sonuçlarını 4-5 saat sonra almanızı sağlar.
4. Yöntem neredeyse %100 güvenilirdir. Yalnızca izole yanlış negatif sonuç vakaları kaydedilmiştir.
5. Tek bir malzeme örneğinden çeşitli patojen türlerini tanımlama imkanı. Bu sadece hastalığın teşhis sürecini hızlandırmakla kalmaz, aynı zamanda malzeme maliyetlerini de önemli ölçüde azaltır. Genellikle doktor reçete eder karmaşık analiz PCR. Altı patojenin belirlenmesinden oluşan muayenenin fiyatı yaklaşık 1.500 ruble.

PCR çalışması sırasında sonuçların güvenilir olması için, aşağıdaki önerilere uyarak analizden geçmek gerekir. ön hazırlık teşhis için:

1. Tükürük bağışından önce, materyali almadan 4 saat önce yemek yemekten ve ilaç almaktan kaçınmalısınız. İşlemden hemen önce ağzınızı kaynamış su ile çalkalayın.
2. Yanağın iç yüzeyinden örnek alınırken de yukarıdaki kurallara uyulmalıdır. Durulamadan sonra, bezin sırrını vurgulamak için hafif bir cilt masajı yapılması önerilir.
3. İdrar genellikle evde toplanır. Bunu yapmak için, cinsel organların kapsamlı bir tuvaletini yapmanız gerekir. 50-60 ml idrarı steril plastik bir kapta toplayın. Malzemenin saflığını sağlamak için kadınların vajinaya tampon yerleştirmesi ve erkeklerin deri kıvrımını mümkün olduğunca çekmesi önerilir. Adet akışı sırasında malzemeyi alamazsınız.
4. Sperm bağışlamak için materyali toplamadan önce 3 gün cinsel ilişkiden kaçınmalısınız. Doktorlar ayrıca saunayı ziyaret etmemeyi ve sıcak duş alkol ve baharatlı yiyecekler içmek. Analizden 3 saat önce idrar yapmaktan kaçınmanız gerekir.
5. Doğum için örneğin klamidya için PCR testi yapılırsa hem kadınların hem de erkeklerin 3 gün cinsel dinlenmeleri önerilir. Antibakteriyel ilaçlar analizden 2 hafta önce alınmamalıdır. Bir hafta boyunca samimi jeller, merhemler, vajinal fitiller, duş kullanmayı bırakmanız gerekir. Muayeneden 3 saat önce idrar yapmaktan kaçınmalısınız. Adet sırasında, materyal örneklemesi yapılmaz, kan akışının kesilmesinden sadece 3 gün sonra ürogenital smear alabilirsiniz.

hamilelik sırasında PCR

Bebek beklerken cinsel yolla bulaşan birçok enfeksiyon fetüsün normal gelişimi için son derece tehlikelidir. STD'ler intrauterin büyüme geriliği, düşük veya erken doğum, çocuğun konjenital malformasyonlarını provoke edebilir. Bu nedenle erken gebelikte PCR muayenesinden geçmek son derece önemlidir. Kayıt sırasında analizi geçmek gerekir - 12 haftaya kadar.



Materyal özel bir fırça kullanılarak servikal kanaldan alınır. İşlem ağrısızdır ve bebek için tehlike oluşturmaz. Genellikle hamilelik sırasında, PCR yöntemiyle klamidya ve ayrıca üreaplazmoz, mikoplazmoz, sitomegalovirüs, herpes, papilloma virüsü için bir analiz yapılır. Böyle bir inceleme kompleksine PCR-6 denir.

HIV teşhisi için PCR

Yöntemin vücuttaki değişikliklere ve teşhis koşullarına çok duyarlı olması nedeniyle sonucu birçok faktör etkileyebilir. Bu nedenle HIV enfeksiyonu için PCR analizi güvenilir bir yöntem değildir, etkinliği %96-98'dir. Geriye kalan %2-4 vakada test yanlış pozitif sonuçlar verir.

Ancak bazı durumlarda, HIV'in PCR teşhisi olmadan yapılamaz. Genellikle yanlış negatif ELISA sonucu olan kişilere verilir. Bu tür göstergeler, bir kişinin henüz virüse karşı antikor geliştirmediğini ve sayılarında birden fazla artış olmadan tespit edilemediğini gösterir. PCR yöntemini kullanarak bir kan testi yaparak tam olarak bu elde edilebilir.

Bu tür teşhisler, HIV pozitif bir anneden doğan yaşamın ilk yılındaki çocuklar için de gereklidir. yöntem tek yoldur güvenilir tanımçocuk durumu.

Hepatit teşhisi için PCR

Polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi, hepatit A, B, C virüsünün DNA'sını enfeksiyona karşı antikor oluşumundan veya hastalığın semptomlarının başlamasından çok önce tespit etmeyi mümkün kılar. Hepatit C için PCR analizi özellikle etkilidir, çünkü vakaların% 85'inde bu hastalık asemptomatiktir ve zamanında tedavi olmadan kronik aşamaya geçer.



Patojenin zamanında tespiti, komplikasyonlardan ve uzun süreli tedaviden kaçınmaya yardımcı olacaktır.

Kapsamlı PCR incelemesi

Kapsamlı PCR analizi: aynı anda çeşitli enfeksiyon türlerinin belirlenmesini içeren polimerik zincir reaksiyon yöntemiyle inceleme: mikoplazma genitalium, mikoplazma hominis, gardnerella vajinalis, kandida, Trichomonas, sitomegalovirüs, herpes tip 1 ve 2, gonore, papillomavirüs. Bu tür teşhislerin fiyatı 2000 ila 3500 ruble arasında değişmektedir. kliniğe, kullanılan malzeme ve ekipmana ve ayrıca analiz türüne bağlı olarak: nitel veya nicel. Sizin durumunuzda gerekli olan - doktor karar verecektir. Bazı durumlarda, sadece patojenin varlığını belirlemek yeterlidir, diğerlerinde, örneğin HIV enfeksiyonu ile nicel bir titre önemli bir rol oynar. Yukarıdaki patojenlerin tümü teşhis edilirken incelemeye "PCR-12 analizi" denir.

Analiz sonuçlarının deşifre edilmesi

PCR analizinin şifresini çözmek zor değildir. Göstergenin sadece 2 ölçeği vardır - "olumlu sonuç" ve "olumsuz sonuç". Bir patojen tespit edildiğinde, doktorlar hastalığın varlığını %99 kesinlik ile doğrulayabilir ve hastayı tedavi etmeye başlayabilir. Enfeksiyonu belirlemek için nicel bir yöntemle ilgili sütun, tespit edilen bakterilerin sayısal göstergesini gösterecektir. Sadece bir doktor hastalığın derecesini belirleyebilir ve gerekli tedaviyi reçete edebilir.



Bazı durumlarda, örneğin, PCR ile HIV enfeksiyonunu olumsuz bir sonuçla belirlerken, elde edilen göstergeleri doğrulamak için ek incelemeler yapmak gerekli hale gelir.

Analizi nereden almalı?

PCR analizi nerede yapılır: kamu kliniğinde mi yoksa özel laboratuvarda mı? Ne yazık ki, belediye sağlık kurumlarında, ekipman ve yöntemler genellikle eskidir. Bu nedenle, modern ekipmana ve yüksek nitelikli personele sahip özel laboratuvarları tercih etmek daha iyidir. Ayrıca, içinde özel klinikçok daha hızlı sonuç alırsınız.

Moskova'da birçok özel laboratuvar, çeşitli enfeksiyonlar için PCR analizi sunmaktadır. Örneğin Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro gibi kliniklerde PCR analizi yapılmaktadır. Muayenenin fiyatı 200 ruble. Tek bir patojenin tanımlanması için.

Çoğu durumda PCR ile bulaşıcı hastalıkların teşhisinin, vücuttaki patojeni enfeksiyonun erken evrelerinde tespit etmenin hızlı ve güvenilir bir yolu olduğu sonucuna varılabilir. Ancak yine de, bazı durumlarda diğer teşhis yöntemlerini seçmeye değer. Böyle bir çalışmaya duyulan ihtiyacı yalnızca bir uzman belirleyebilir. PCR analizinin deşifre edilmesi de profesyonel bir yaklaşım gerektirir. Doktorunuzun talimatlarına uyun ve ihtiyacınız olmayan testleri yaptırmayın.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)- sentetik oligonükleotit primerleri tarafından indüklenen nükleik asitlerin spesifik bir amplifikasyonu olan deneysel moleküler biyoloji yöntemi laboratuvar ortamında.

PCR yöntemini geliştirme fikri, 1983 yılında DNA polimeraz enzimini yapay koşullar altında kullanarak döngüsel çiftlemeler sırasında DNA'yı çoğaltmayı mümkün kılan bir yöntem yaratan Amerikalı araştırmacı Kary Mullis'e aittir. Bu fikrin yayınlanmasından birkaç yıl sonra, 1993 yılında K. Mullis bunun için aldı. Nobel Ödülü.

Yöntemi kullanmaya başlarken, her ısıtma-soğutma döngüsünden sonra reaksiyon karışımına DNA polimeraz eklenmesi gerekiyordu, çünkü hızlı bir şekilde inaktive edildi. Yüksek sıcaklık. Prosedür çok verimsizdi, çok fazla zaman ve enzim gerektiriyordu. 1986'da termofilik bakterilerden DNA polimeraz kullanılarak önemli ölçüde modifiye edildi. Bu enzimler, PCR'yi otomatikleştirmenize izin veren birçok reaksiyon döngüsüne dayanabilir. En yaygın olarak kullanılan termostabil DNA polimerazlardan biri bakterilerden izole edilmiştir. termos aquaticus ve adlandırılmış tak-DNA polimeraz.

Yöntemin özü. Yöntem, Taq-DNA polimeraz enzimi kullanılarak belirli bir DNA bölgesinin çoklu seçici kopyalanmasına dayanır. Polimeraz zincir reaksiyonu, uzunluğu birkaç bin baz çiftine kadar olan amplifikasyonların elde edilmesini mümkün kılar. PCR ürününün uzunluğunu 20-40 bin baz çiftine çıkarmak için çeşitli polimerazların bir karışımı kullanılır, ancak yine de ökaryotik bir hücrenin kromozomal DNA'sının uzunluğundan çok daha azdır.

Reaksiyon, programlanabilir bir termostatta (amplifikatör) gerçekleştirilir - yeterince hızlı gerçekleştirebilen bir cihaz

test tüplerinin soğutulması ve ısıtılması (genellikle en az 0.1 °C hassasiyetle). Amplifikatörler, "sıcak başlangıç" ve ardından depolama olasılığı olanlar da dahil olmak üzere karmaşık programlar ayarlamanıza izin verir. Gerçek zamanlı PCR için floresan dedektörlü cihazlar üretilir. Cihazlar ayrıca otomatik kapaklı ve mikroplaka bölmesiyle de mevcuttur ve bu sayede otomatik sistemlere entegre edilebilirler.

Genellikle, PCR sırasında, her biri üç aşamadan oluşan 20-45 döngü gerçekleştirilir: denatürasyon, primer tavlama, uzama (Şekil 6.1 ve 6.2). Şek. 6.1, PCR döngüsü sırasında test tüpündeki sıcaklık değişikliklerinin dinamiklerini gösterir.

Pirinç. 6.1. Polimeraz zincir reaksiyonunun bir döngüsü sırasında test tüpündeki sıcaklıktaki değişimin grafiği

DNA şablonu denatürasyonu DNA zincirlerinin dağılması için reaksiyon karışımının 5-90 s boyunca 94-96 °C'ye ısıtılmasıyla gerçekleştirilir. İlk döngüden önce, başlangıç ​​matrisini tamamen denatüre etmek için reaksiyon karışımının 2-5 dakika önceden ısıtıldığına ve bu da spesifik olmayan reaksiyon ürünlerinin miktarını azaltmayı mümkün kıldığına dikkat edilmelidir.

Pirinç. 6.2. Polimeraz zincir reaksiyonunun ilk döngüsünün şeması

Primer tavlama aşaması. Sıcaklıkta kademeli bir düşüşle, primerler şablona tamamlayıcı olarak bağlanır. Tavlama sıcaklığı, primerlerin bileşimine bağlıdır ve genellikle hesaplanan erime sıcaklığından 4-5°C daha düşüktür. Aşamanın süresi 5-60 s'dir.

Bir sonraki aşamada - uzama- anne matriksinde DNA'nın kızı zincirinin bir sentezi var. Uzama sıcaklığı polimeraza bağlıdır. Yaygın olarak kullanılan Taq ve Pfu DNA polimerazları en çok 72°C'de aktiftir. Esas olarak PCR ürününün uzunluğuna bağlı olan uzama süresi, tipik olarak 1000 baz çifti başına 1 dakikadır.